脆性X綜合征PCR篩查方法學(xué)的建立.pdf

1、目的： 脆性X綜合征(Fragile X Syndrome)是一種常見(jiàn)的遺傳性智力低下綜合征，其發(fā)病率僅次于Down's綜合征，呈X連鎖遺傳。男性發(fā)病率為1/4000，女性為1/6000-8000。大多數(shù)的脆性X綜合征男性患者，存在顯著的智力低下，IQ值在20～70之間，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)障礙，重度智力低下及自閉癥樣行為。 脆性X綜合征發(fā)病的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是脆性X綜合征智力低下基因1(Fragile X mental retar

2、dation gene1，F(xiàn)MR1基因)(CGG)n結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展突變。(CGG)n重復(fù)序列的長(zhǎng)度具有多態(tài)性，并且可以遺傳，在遺傳過(guò)程中易發(fā)生突變。當(dāng)n擴(kuò)展達(dá)到200次以上時(shí)，這種突變類型為全突變，常伴CpG島異常甲基化，F(xiàn)MR1基因失活，導(dǎo)致FMRP缺失，引起脆性X綜合征。 脆性X綜合征發(fā)病率在遺傳性智力低下綜合征中排第二位，該病的產(chǎn)生給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。因?yàn)槟壳吧形闯霈F(xiàn)明確有效的治愈方法，所以防治本病

3、的關(guān)鍵在于降低其發(fā)病率，開(kāi)展廣泛的篩查工作，對(duì)攜帶者及患者予以遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，阻止患兒的出生。 目前美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)協(xié)會(huì)已公布出進(jìn)行FMR1分子診斷的適用人群；大多數(shù)國(guó)家則已對(duì)脆性X綜合征開(kāi)始實(shí)行針對(duì)性篩查，即針對(duì)通過(guò)家族史分析而確定的高危孕婦進(jìn)行篩查；而部分國(guó)家，如芬蘭、以色列，更是在孕婦中進(jìn)行常規(guī)篩查。在各國(guó)對(duì)脆性X綜合征都已有了正規(guī)的程序化的篩查診斷時(shí)，我國(guó)至今還沒(méi)有任何針對(duì)脆性X綜合征篩查的產(chǎn)品的問(wèn)世，也仍未曾進(jìn)行過(guò)廣

4、泛的篩查診斷工作，在脆性X綜合征篩查診斷和防治方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他國(guó)家。 脆性X綜合征的篩查診斷難以普及、各國(guó)沒(méi)有統(tǒng)一的篩查診斷方案，緣于脆性X綜合征的臨床表現(xiàn)多樣，臨床診斷困難，必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷，而現(xiàn)有的各種脆性X綜合征實(shí)驗(yàn)室篩查技術(shù)又存在以下的問(wèn)題：費(fèi)用昂貴；費(fèi)時(shí)；條件、技術(shù)要求高；適用范圍不廣等。 所以本實(shí)驗(yàn)擬建立一個(gè)費(fèi)用低廉；快速；操作簡(jiǎn)便，技術(shù)要求低；可以涵蓋男性、女性受檢者，包括(CGG)n正常范圍、所有前突

5、變及部分全突變的脆性X綜合征PCR篩查方法。 方法： 本實(shí)驗(yàn)包括2項(xiàng)主要內(nèi)容： 1、快速DNA重亞硫酸氫鹽修飾。常規(guī)方法是使用氫氧化鈉將DNA化學(xué)變性，加入重亞硫酸氫鹽等過(guò)夜修飾單鏈DNA，用氫氧化鈉使DNA脫磺化完成向尿嘧啶的轉(zhuǎn)化并用樹(shù)脂純化修飾后的DNA。本實(shí)驗(yàn)將預(yù)先準(zhǔn)備好的DNA修飾粉劑配制成新鮮的DNA修飾液與DNA混合后，采用溫度變性(99℃)取代以往方案中的化學(xué)變性過(guò)程，在5min熱變性后直接過(guò)夜修飾

6、，再用達(dá)安研發(fā)的試劑盒使DNA脫磺化并純化DNA。 2、脆性X綜合征PCR體系建立。以修飾后的DNA反義鏈為模板在(CGG)n兩側(cè)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和ABI3100測(cè)序儀片段分析檢測(cè)(CGG)n重復(fù)次數(shù)，并進(jìn)一步克隆、測(cè)序驗(yàn)證。 結(jié)果： 1、經(jīng)克隆測(cè)序驗(yàn)證兩種方法對(duì)(CGG)n的修飾均可達(dá)到100％，但采用快速方法的得率更高，其PCR產(chǎn)物電泳條帶比常規(guī)方法更亮，該方法還縮短了時(shí)間，

7、避免樹(shù)脂純化時(shí)正壓排液的不便，更方便臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。 2、通過(guò)測(cè)試4個(gè)(CGG)n重復(fù)次數(shù)已知的前突變、全突變男性和女性細(xì)胞株DNA、2個(gè)正常范圍的男性和女性DNA，該優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系可以擴(kuò)增出大片段的(CGG)n重復(fù)序列，涵蓋所有前突變及部分全突變序列。應(yīng)用ABI3100測(cè)序儀片段分析可精確檢測(cè)部分(CGG)n重復(fù)次數(shù)，通過(guò)優(yōu)化PCR添加劑，避免重復(fù)序列常見(jiàn)的影子帶，令分子診斷得出最準(zhǔn)確的結(jié)果。 結(jié)論：