PBC膽汁排泄障礙相關(guān)分子的篩選和功能研究.pdf

1、【背景】
　　近二十年來(lái)，隨著人們生活習(xí)慣和環(huán)境因素的改變，PBC全球患病率提高了近十倍。作為重要的非病毒性肝病之一，其危害性不容忽視，已受到相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业母叨戎匾暋?br>　　應(yīng)用熊去氧膽酸類藥物（UDCA）能顯著改善PBC患者肝臟的生化功能，在一定程度上延緩疾病的進(jìn)展，但并不能從根本上治愈PBC，且患者早期缺乏特異性癥狀，往往因肝硬化失代償期的嚴(yán)重并發(fā)癥就診才得以診斷，失去了治療的最佳時(shí)期。目前研究認(rèn)為PBC發(fā)病可能跟環(huán)境、遺

2、傳、及免疫因素有關(guān)，但具體病因及發(fā)病機(jī)制仍不明。由于PBC的臨床表現(xiàn)、病理變化、生化指標(biāo)的典型特征均為肝內(nèi)膽汁淤積，因此從膽汁排泄障礙角度入手，有望加深對(duì)PBC發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　內(nèi)、外源性物質(zhì)及膽汁酸鹽等成分吸收入肝細(xì)胞起始于肝細(xì)胞基底側(cè)膜，經(jīng)過(guò)肝細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化及運(yùn)輸后經(jīng)過(guò)頂端側(cè)膜即膽管側(cè)膜分泌入小膽管，形成膽汁。肝細(xì)胞膽管膜側(cè)存在著許多轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子，在膽汁排泄中發(fā)揮著重要的作用。MDR3為磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)將磷酸卵磷脂由胞內(nèi)向

3、胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)。BSEP為膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)牛黃鵝脫氧膽酸、牛熊去氧膽酸鹽、牛磺膽酸等膽鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)。ABCG5/8參與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。目前已發(fā)現(xiàn)多種膽汁淤積性疾病均是由于肝細(xì)胞膽管膜側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子基因突變或蛋白變異所致，如PFIC-1與定位在染色體18q21-22的ATP8B1基因突變導(dǎo)致FIC1缺陷有關(guān)，PFIC-2是由膽汁酸鹽輸出泵基因突變導(dǎo)致，PFIC-3與定位于染色體7q21的多藥耐藥蛋白MDR3/ABCB4基因突變有關(guān),Dubin-J

4、ohnson綜合征發(fā)生的重要原因是由于MRP2/ABCC2突變。PBC患者中，也發(fā)現(xiàn)了肝細(xì)胞膽管側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)分子表達(dá)分布的變化，與BSEP和MDR3基因突變、AE2表達(dá)下調(diào)和功能降低有關(guān)，但是目前已知的轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化并不能完全解釋PBC膽汁排泄障礙這一復(fù)雜的病理生理現(xiàn)象，因此篩選與PBC發(fā)病密切相關(guān)的膽汁排泄相關(guān)分子有望闡明PBC膽汁排泄障礙的機(jī)制。
　　【目的】
　　制備和篩選與PBC相關(guān)的肝細(xì)胞膽管膜側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子單克隆抗體，鑒

5、定其抗原并初步探討其在PBC發(fā)病中的作用。
　　【方法】
　　1．利用我們前期建立的蔗糖和percoll聯(lián)合的密度梯度離心方法提取PBC肝臟肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體。
　　2．應(yīng)用單克隆抗體雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，并通過(guò)ELISA、免疫組化方法及免疫熒光雙標(biāo)共聚焦方法篩選特異性分布于肝細(xì)胞并呈極性分布的單克隆抗體。
　　3．收集正常、不同肝臟疾病包括PBC的肝臟，通過(guò)免疫組化方法觀察單克隆抗體在不同疾病狀態(tài)下表達(dá)分布

6、的變化篩選與PBC相關(guān)的單克隆抗體并通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法分析其病理意義。
　　4．通過(guò)免疫電鏡技術(shù)觀察1F9在肝細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，分析其可能的作用。
　　5．通過(guò)免疫沉淀、westernblot方法初步鑒定1F9抗原。
　　【結(jié)果】
　　1．從PBC肝臟中分離的肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體為形態(tài)均一、結(jié)構(gòu)規(guī)整、直徑約400nm左右的囊狀小體，肝細(xì)胞膽管側(cè)膜小體（CMV）ALP活性顯著高于肝細(xì)胞血竇側(cè)膜小體（SMV），Na+K+A

7、TP酶活性顯著低于SMV，說(shuō)明我們成功分離了PBCCMV。
　　2．制備的單克隆抗體經(jīng)過(guò)特異性篩選后共有四株即1F2、1F3、1F5、1F9可極性分布于肝細(xì)胞膜，與肝細(xì)胞膽管膜側(cè)標(biāo)志分子CD13共定位結(jié)果證實(shí)這些抗體均特異性分布于肝細(xì)胞膽管膜側(cè)。
　　3．1F2、1F3、1F5、1F9在正常及不同疾病狀態(tài)下的表達(dá)分布的免疫組化結(jié)果提示1F9可能與PBC相關(guān)，進(jìn)一步對(duì)40例正常肝臟、30例乙肝病毒性肝炎、20例脂肪性肝炎、20

8、例Gilbert、20例藥物性肝病及148例PBC的肝臟進(jìn)行免疫組化染色并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證實(shí)1F9與其他肝病無(wú)明顯的相關(guān)性，僅與PBC密切相關(guān)，一方面，隨著PBC病情的進(jìn)展1F9在PBC肝臟的表達(dá)呈增多趨勢(shì)，另一方面，在正常肝臟及其他肝臟疾病肝細(xì)胞呈極性分布的1F9在PBC時(shí)極性分布消失且隨病情進(jìn)展紊亂程度加重。
　　4．免疫電鏡結(jié)果顯示1F9抗原位于肝細(xì)胞頂端內(nèi)涵體囊壁上，通過(guò)比較其與肝細(xì)胞頂端內(nèi)涵體標(biāo)志分子Rab11a在組織

9、中的分布及分子量，發(fā)現(xiàn)1F9抗體識(shí)別的抗原并不是Rab11a，可能為肝細(xì)胞頂端內(nèi)涵體的新的標(biāo)志分子。
　　【結(jié)論】
　　1．我們共獲得了四株在肝細(xì)胞膽管膜側(cè)特異性分布的單克隆抗體，它們分別是1F2、1F3、1F5、1F9。
　　2．獲得的其中一株與PBC密切相關(guān)、對(duì)PBC具有重要病理診斷價(jià)值—單克隆抗體1F9，其抗原可能通過(guò)影響內(nèi)涵體的功能而影響肝細(xì)胞極性分子的準(zhǔn)確定位最終影響肝細(xì)胞的極性及膽汁的排泄。
　　3．