端粒酶及TERT在實(shí)驗(yàn)性小鼠CVB3心肌炎的作用及黃芪甲甙干預(yù)研究.pdf

1、第一部分柯薩奇B3病毒性心肌炎小鼠循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶和干細(xì)胞的時(shí)空變化的研究 目的：病毒性心肌炎引起的心肌損傷作用機(jī)制并未完全清楚。本研究通過柯薩奇B3病毒性心肌炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察柯薩奇B3病毒性心肌炎循環(huán)血及心肌內(nèi)端粒酶活性及TERT和干細(xì)胞時(shí)空變化特征，探討其在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用。 方法：小鼠隨機(jī)接受病毒培養(yǎng)基(對(duì)照組，CON組)或病毒液(病毒組，VIR組)注射。隨后，動(dòng)物根據(jù)以下幾時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步分為六小

2、組：注射后1天、3天、7天、14天、21天和28天。另取10只正常小鼠作正常對(duì)照組(NOR組)。從動(dòng)物眼球取血分離得到循環(huán)血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析其干細(xì)胞標(biāo)記、TaqMan實(shí)時(shí)定量RT—PCR、免疫印跡技術(shù)和TRAP—ELISA法分別用來測(cè)定心肌內(nèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)mRNA和蛋白水平變化以及端粒酶活性變化情況。利用H&E染色、組織學(xué)及免疫熒光染色技術(shù)觀察心肌炎癥反應(yīng)、干細(xì)胞標(biāo)記物及粒細(xì)胞過氧化酶(MPO)和活性氧(ROS

3、)變化。 結(jié)果：1．MPO和ROS含量于感染后3天達(dá)高峰，感染后28天，基本回到正常水平。CON組與NOR組之間，MPO和ROS含量無顯著性差異(p＞0.05)。 2．與正常組比較，對(duì)照組各時(shí)段小鼠循環(huán)血CD44+CD106+干細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物)和Sca—1+CD45+干細(xì)胞(造血干細(xì)胞)無顯著性差異(p＞0.05)。而病毒組，循環(huán)血CD44+CD106+間充質(zhì)干細(xì)胞含量于感染后3天達(dá)高峰，7天下降，而于14天基

4、本恢復(fù)正常水平。同時(shí)，循環(huán)血Sca—1+CD45+造血干細(xì)胞含量于感染后1天開始增加，并持續(xù)至感染后14天。 3．心臟中Sca—1抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)于感染后3天明顯增加，7天達(dá)高峰，14天仍保持不變，而28天明顯減少。各對(duì)照組之間局部心臟干細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。 4．與NOR組和CON組比較，病毒組小鼠端粒酶表達(dá)明顯下降(p＜0.05)。病毒組TERTmRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平于感染后7天和14天明顯增高，于21天下降

5、。端粒酶活性也在感染后7天和14天明顯增高。而NOR組和CON組各時(shí)段TERT表達(dá)水平和端粒酶活性無顯著性改變(p＞0.05)。 5．感染后14天心肌細(xì)胞內(nèi)和血管內(nèi)皮細(xì)胞TERT陽性染色密度明顯多于感染后3天，但兩者均明顯少于正常組(p＜0.05)。 結(jié)論：本研究結(jié)果表明病毒性心肌炎小鼠中干細(xì)胞和端粒酶活性及TERT表達(dá)呈明顯時(shí)相性變化，提示在心肌損傷的病理狀態(tài)下，通過動(dòng)員干細(xì)胞機(jī)制和調(diào)控端粒酶活性及TERT表達(dá)，促進(jìn)受

6、損心肌細(xì)胞再生與修復(fù)，在病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制中具有重要意義。 第二部分黃芪甲甙對(duì)病毒性心肌炎心肌端粒酶作用的研究 目的：觀察黃芪甲甙不同劑量干預(yù)后對(duì)病毒性心肌炎小鼠端粒酶活性及其逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)的表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討其治療病毒性心肌炎的藥理作用機(jī)制。 方法：Balb/c雄性4周齡小鼠54只，隨機(jī)分為5組：A組(正常空白對(duì)照組，腹腔接種0.1ml不含病毒的培養(yǎng)液+0.1ml羥甲基纖維素鈉鹽溶液灌胃2周，每日1次，

7、n=10)，B組(正常黃芪對(duì)照組，腹腔接種病毒培養(yǎng)液+0.1ml9％黃芪甲甙灌胃2周，每日1次，n=10)，C組(高劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3+0.1ml9％黃芪甲甙灌胃，n=10)，D組(低劑量黃芪治療組，腹腔接種同劑量CVB3+0.1ml1％黃芪甲甙灌胃，n=10)，E組(模型組，腹腔接種同劑量CVB3+羥甲基纖維素溶液灌胃，n=14)。觀察14d后，眼球采血后處死動(dòng)物，摘取心臟組織。分析各組小鼠的死亡率；用TRAP—E

8、LISA法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒酶活性；RT—PCR技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞TERT表達(dá)。 結(jié)果：A組，B組，C組，D組，E組的小鼠死亡率分別為0％、0％、10％、30％和50％，C組死亡率明顯低于D組和E組(p＜0.05)，后2組之間無顯著差異。TRAP—ELISA結(jié)果顯示，A組、B組和C組外周血單個(gè)核細(xì)胞端粒酶活性均呈陽性，三者之間無顯著差異，而D組和E組均為陰性。RT—PCR結(jié)果表明，C組TERT表達(dá)明顯高于D組和E組(p＜0.