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1、本課題研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)方面:1、神經(jīng)生長因子緩釋微球的制備及評(píng)價(jià);2、神經(jīng)干細(xì)胞移植后在AD模型鼠基底前腦內(nèi)的遷移和分化;3、神經(jīng)生長因子緩釋微球、神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合治療AD模型鼠。 第一章、神經(jīng)生長因子緩釋微球的制備及評(píng)價(jià)。 一、材料和方法:采用水/油/水(WI/O/W2)的雙乳化技術(shù)來制備神經(jīng)生長因子緩釋微球。將5mg蛋白(rhNGF/FITC-BSA1/2000,w/w)溶于100tall去離子水中,100 mg PL
2、GA溶于4ml二氯甲烷/丙酮(3:1,v/v)的混合溶液中,將蛋白溶液加到PLGA溶液中,在冰浴條件下超聲1min(超聲功率為20W),即形成油包水(W1/O)型的乳液。然后,將蛋白和PLGA的混合溶液加入25ml 1%PVA的水溶液中,在冰浴的條件下勻速攪拌5min(1000rpm),即形成水包油包水(W1/O/W2)型的復(fù)乳液。在常壓下,磁力攪拌3-4h,揮發(fā)有機(jī)溶劑,固化的微球通過離心(12000rpm,10min,)收集,用去離
3、子水清洗三遍除掉微球表面的PVA和沒有包進(jìn)的藥物,最后冷凍干燥24h,去除微球中的水分。并研究不同條件和添加劑對(duì)蛋白包封率的影響。將神經(jīng)生長因子緩釋微球注射入鼠的基底前腦,觀察其在體內(nèi)的釋放。 二、結(jié)果: 蛋白/多聚物比率越高,載藥量也越高,但是蛋白包封率則越低;當(dāng)?shù)鞍?PLGA比率由5/100(w/w)增加到15/100(w/w)時(shí),包封率則由89.1%下降到56.5%。乳化前將水溶性添加劑加入內(nèi)水相能夠明顯提高蛋白的
4、包封率。內(nèi)水相中加入聚乙二醇能夠?qū)饴蕪?9.1%提高到97.5%。神經(jīng)生長因子緩釋微球能夠持續(xù)釋放有生物學(xué)活性的神經(jīng)生長因子達(dá)35天,且初時(shí)爆破釋放較低。神經(jīng)生長因子緩釋微球能夠在基底前腦持續(xù)釋放神經(jīng)生長因子達(dá)4周以上。 第二章、神經(jīng)干細(xì)胞移植后在.AD模型鼠基底前腦內(nèi)的遷移和分化。 一、材料和方法:新生的SD大鼠的基底前腦,機(jī)械分離后胰酶消化,制成單細(xì)胞懸液,加入含2%B27、表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維生長
5、因子(FGF-2)(終濃度均為10ng/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)基,放置在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待原代克隆形成后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液,按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。以后每5~7天分離克隆傳代一次,方法同前。用10%的小牛血清誘導(dǎo)貼壁的神經(jīng)干細(xì)胞分化。用BrdU(6μg/ml)標(biāo)記傳代培養(yǎng)的細(xì)胞。用免疫細(xì)胞化學(xué)方法,行Nestin、NF、GFAP、BrdU染色,鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力和分化潛能。雄性SD大鼠(250.300g),單側(cè)切斷
6、穹隆-海馬傘(FF),以制備隔-海馬通路損傷的AD模型。大鼠切斷FF,將神經(jīng)干細(xì)胞4ul(2.5×1<'4>個(gè)/μl)移植入基底前腦,坐標(biāo)為:前囟+0.6mm,外側(cè)+0.6mm插入,腹側(cè)-5.5mm。分別在1、2、3、4周檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化情況。 二、結(jié)果: 神經(jīng)干細(xì)胞能夠在EGF和FGF-2的刺激下分裂增殖,1周左右形成由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球。傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞具有與原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞相
7、同的生物學(xué)特性,并能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,分別呈NF、GFAP陽性??寺〖?xì)胞球染色,顯示Nestin和Brdu標(biāo)記陽性反應(yīng)。免疫熒光標(biāo)記檢測(cè),貼壁的細(xì)胞為DAPI+Brd[J+GFAP陽性反應(yīng)或者DAPI+BrdU+NF陽性反應(yīng)。移植后1周,大部分移植細(xì)胞聚集在移植的針道附近,結(jié)果顯示Nestin陽性,細(xì)胞胞體較小,向四周伸出突起。移植后2周,細(xì)胞向附近的腦組織遷移,部分細(xì)胞遷移到相對(duì)較遠(yuǎn)的地方,部分細(xì)胞與周圍組織整合,Nest
8、in陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。移植后3周、4周,看不到Nestin陽性細(xì)胞;免疫熒光雙標(biāo)染色顯示,移植的針道附近以及基底前腦散在有許多抗Brdl.J+抗NF和抗BrdU+抗GFAP免疫熒光雙標(biāo)陽性細(xì)胞。 第三章、神經(jīng)生長因子緩釋微球、神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療AD模型鼠。 一、材料和方法:青年健康SD雄性大鼠,體重250-310克,共分為3組:①正常對(duì)照組8只;②FF損傷組即模型組8只;③神經(jīng)生長因子緩釋微球治療組12只;④NSC
9、移植治療組12只;⑤神經(jīng)生長因子緩釋微球+NSC移植治療組12只。單側(cè)切斷FF,以toFF通路損傷的AD模型。動(dòng)物模型的建立后,即刻行同側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞移植。接著進(jìn)行同側(cè)神經(jīng)生長因子緩釋微球注射。對(duì)內(nèi)側(cè)隔核、斜角帶核的膽堿能神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)參數(shù)的測(cè)定。并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 二、結(jié)果: 1、神經(jīng)生長因子緩釋微球、神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療對(duì)AD模型鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元的影響穹窿-海馬傘切斷4周后,損傷組損
10、傷側(cè)的MS和vDB的膽堿能陽性神經(jīng)元都大量減少。神經(jīng)生長因子緩釋微球治療組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元得到明顯的保護(hù),明顯高于損傷組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元存活數(shù)(p<0.01),與正常組相比,低于正常組(p<0.05)。NSC移植組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元得到補(bǔ)充和保護(hù),明顯高于損傷組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元存活數(shù)(p<0.01),與正常組相比,低于正常組(p<0.05)。神經(jīng)生長因子緩釋微球、NSC移植聯(lián)合治療組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元得到最為明顯的保護(hù)和
11、補(bǔ)充,明顯高于神經(jīng)生長因子緩釋微球組或者NSC移植組損傷側(cè)的膽堿能神經(jīng)元存活數(shù)(p<0.01),基本達(dá)到正常組水平(P>0.05)。 2、神經(jīng)生長因子緩釋微球、神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植治療對(duì)AD模型鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響Y型迷宮測(cè)試5組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,結(jié)果顯示損傷組大鼠空間學(xué)習(xí)能力明顯下降(P<0.05),記憶能力顯著下降(P<0.01);神經(jīng)生長因子緩釋微球治療組空間學(xué)習(xí)能力得到改善(P<0.05),記憶能力得到顯著提高(P
12、<0.01);NSC移植組空間學(xué)習(xí)能力得到改善(P<0.05),記憶能力得到顯著提高(P<0.01);神經(jīng)生長因子緩釋微球、NSC移植聯(lián)合治療組空間學(xué)習(xí)能力得到顯著改善(P<0.05),記憶能力得到顯著提高(P<0.01);與正常組相比未見差異(P>0.05)。 總之,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,采用水/油/水(W1/O/W2)的雙乳化技術(shù)來制備神經(jīng)生長因子緩釋微球,蛋白/多聚物比率越高,載藥量也越高,蛋白包封率則越低。乳化前將水溶性添加劑
13、加入內(nèi)水相能夠明顯提高蛋白的包封率。神經(jīng)生長因子緩釋微球能夠持續(xù)釋放有生物學(xué)活性的神經(jīng)生長因子達(dá)35天,且初時(shí)爆破釋放較低。體內(nèi)注射結(jié)果顯示神經(jīng)生長因子緩釋微球能夠在基底前腦持續(xù)釋放神經(jīng)生長因子達(dá)4周以上。神經(jīng)干細(xì)胞能夠利用無血清的培養(yǎng)基在EGF和FGF-2刺激下從基底前腦組織中培養(yǎng)獲得,并且能夠在宿主腦內(nèi)存活、遷移和分化,較好地與宿主腦組織整合。單側(cè)切斷FF后,基底前腦MS、VDB的膽堿能陽性神經(jīng)元大量丟失。MS、VDB的膽堿能神經(jīng)元
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