重組pAd-CMV-V5-DEST-p16載體的構建及其對人肝癌細胞的抑制作用.pdf

1、目的：構建pad／CMV／V5一DEST—p16重組腺病毒載體，并觀察野生型p16基因對人肝癌細胞SMMC7721株的抑制作用。 方法：用載體間的DNA相互靈活轉換的多功能系統(tǒng)，即通路克隆系統(tǒng)(gatewaycloningsystem)[1]，構建重組p16腺病毒載體。合成上游含salI、kozak序列[2,3、人p16一INK4表達基因、下游含EcolRI，導入洲D18一Tsimple質粒，轉化到感受態(tài)細胞JM100，測序證實

2、質粒含有目的基因。用salI、EcolRI雙酶切pMD18一Tsimple—p16和pENTR1A質粒，用T4DNA連接酶連接，轉化到感受態(tài)細胞JM1.00中，構建pENTR1A—p16質粒。在通路克隆系統(tǒng)的LR克隆酶催化作用下，通過LR反應，入口克隆pENTR1A—p16質粒的外源性合成的修飾后的p16cDNA，取代目的載體pAdCMV／V5-DEST中的ccdB基因，形成表達克隆一p16重組腺病毒質粒即pad／CMV／V5一DEST

3、-p16。轉化到感受態(tài)細胞DH5α中，測序證實質粒含有目的基因。PacI酶切后的重組腺病毒質粒，通過脂質體2000介導，轉染293A細胞，產生缺陷性的重組腺病毒。Westernblot分析顯示在由重組腺病毒介導的野生型p16基因在肝癌細胞SMMC7721中能夠表達蛋白，被感染的細胞的生長受抑制。結果：構建了重組p16腺病毒載體，產生缺陷性的重組腺病毒，野生型p16基因對人肝癌細胞SMMC7721株有抑制作用。 結論：用通路克隆系