氧化應激及吡格列酮干預對3T3-L1脂肪細胞SOCS-3表達的影響.pdf

1、肥胖在全球范圍內流行，近幾十年來尤其是發(fā)展中國家在經(jīng)濟快速增長、生活方式西化的同時，肥胖發(fā)病率迅速升高，成為新的肥胖重災區(qū)。肥胖同時成為2型糖尿病、動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病的重要危險因素。脂肪組織并非單純能量貯存之器官，脂肪組織做為胰島素敏感性組織，在胰島素抵抗中占有重要地位，它重要的內分泌功能在于其通過分泌多種細胞因子調節(jié)全身胰島素敏感性。
　　 SOCS-3(suppressorofcytokinesignaling-3)是

2、SOCS家族的重要成員之一，近年的許多研究發(fā)現(xiàn)SOCS-3在瘦素抵抗、胰島素信號傳導及胰島素抵抗中亦占有重要作用。已知氧化應激增強是胰島素抵抗發(fā)生機制之一，氧化應激反應如何導致脂肪組織產生胰島素抵抗，機制尚未完全闡明，是否與氧化應激改變了脂肪細胞中SOCS-3的表達有關，相關的實驗研究并不多見。以吡格列酮為代表的噻唑烷二酮類藥物(TZDs)是過氧化物酶體增殖體激活受體-γ(PPAR-γ)激動劑，廣泛使用于胰島素增敏及抗糖尿病治療，它通過

3、調節(jié)靶基因表達發(fā)揮多種作用改善胰島素敏感性，吡格列酮干預對氧化應激情況下SOCS-3的表達是否存在影響亦不清楚。
　　 本課題以成熟的3T3-L1脂肪細胞為研究對象，給予不同形式的H2O2刺激，使細胞內ROS(ReactiveOxygenSpecies)水平增高、模擬氧化應激反應增強的狀態(tài)，流式細胞技術檢測3T3-L1脂肪細胞內ROS的變化，繼而利用real-timePCR及Western-blot等方法觀察脂肪細胞中SOCS-

4、3表達的變化并初步探討其可能的機制。本實驗同時觀察抗氧化劑α-硫辛酸、PPAR-γ激動劑吡格列酮的干預對3T3-L1脂肪細胞在氧化應激增強情況下SOCS-3表達的影響，以期加深對脂肪組織胰島素抵抗發(fā)生機制的理解，并提出對胰島素抵抗預防、治療方向的新探討。
　　 一、材料和方法：
　　 1.細胞誘導
　　 通過IBMX+地塞米松+胰島素的三聯(lián)誘導劑方案誘導3T3-L1前脂肪細胞轉變?yōu)槌墒熘炯毎?，通過油紅染色及定量

5、Real-timePCR檢測脂聯(lián)素mRNA表達水平兩種方法，鑒定成熟脂肪細胞。
　　 2.氧化應激及抗氧化劑干預
　　 ①Ctrl組：成熟3T3-L1脂肪細胞
　　 ②H組：直接對3T3-L1脂肪細胞給予較高濃度H2O2(0.5mmol/L)短暫刺激15分鐘，模擬急性的氧化應激增強。
　　 H1組H2O2(0.5mmol/L)5分鐘
　　 H2組H2O2(0.5mmol/L)10分鐘
　　

6、 ③GO組：葡萄糖氧化酶(100mIU/L)與高糖培養(yǎng)基緩慢作用4小時產生持續(xù)較低濃度的H2O2，模擬較為溫和持久增強的氧化應激反應。
　　 ④GO+LA組：葡萄糖氧化酶(100mIU/L)處理4小時，同時α-硫辛酸(2.5mmol/L)做為抗氧化劑干預。
　　 通過流式細胞儀檢測確定細胞內ROS水平的增高，利用real-timePCR及Western-blot方法檢測3T3-L1脂肪細胞中SOCS-3mRNA及蛋白表達

7、水平的變化，real-timePCR檢測脂聯(lián)素、抵抗素，腫瘤壞死因子等脂肪因子的mRNA水平變化。ELISA法測定脂聯(lián)素的蛋白水平。
　　 3.氧化應激及吡格列酮干預
　　 ①Ctrl組：成熟3T3-L1脂肪細胞
　　 ②GO組：葡萄糖氧化酶(100mIU/L)處理4小時
　　 ③GO+PGZ組：PPAR-γ激動劑吡格列酮(10μmol/L)12小時預處理后，葡萄糖氧化酶(100mIU/L)處理4小時。<

8、br>　　 觀察在持續(xù)增高的過氧化氫刺激狀態(tài)下，吡格列酮對細胞內ROS水平變化及SOCS-3mRNA及蛋白表達水平、脂聯(lián)素mRNA的影響。實驗檢測方法同2。
　　 二、主要結果：
　　 1、①成熟的3T3-L1脂肪細胞中可見多量紅色脂滴聚集，在誘導分化8至10天時通過油紅染色清晰可見。檢測脂肪細胞的marker基因-脂聯(lián)素mRNA，在誘導分化過程中逐漸增高。由此判斷3T3-L1前脂肪細胞誘導為成熟脂肪細胞。
　　

9、 ②流式細胞儀檢測H，H1，H2組及GO組的3T3-L1脂肪細胞內ROS熒光強度均明顯增強(P<0.05)，GO+LA組中的ROS熒光強度低于GO組(P<0.05)。
　　 ③H1，H2組脂肪細胞中SOCS-3mRNA及蛋白表達與對照組相比有上升趨勢，H2組中的變化達到統(tǒng)計學差異。(P<0.05)；
　　 H組及GO組3T3-L1脂肪細胞中SOCS-3mRNA及蛋白表達均明顯增高(P<0.05)，其中GO組變化更為明顯

10、，Real-timePCR結果顯示SOCS-3mRNA較對照組增高4-6倍(P<0.05)。GO+LA干預組與GO組相比，3T3-L1脂肪細胞SOCS-3表達水平下降(P<0.05)。
　　 ④H組及GO組3T3-L1脂肪細胞中，抵抗素、腫瘤壞死因子-αmRNA水平上升(P<0.05)，脂聯(lián)素mRNA水平及培養(yǎng)基中脂聯(lián)素蛋白濃度均下降(P<0.05)。GO+LA組脂聯(lián)素mRNA及培養(yǎng)基中濃度較GO組上升(P<0.05)，抵抗素和

11、腫瘤壞死因子-αmRNA水平下降(P<0.05)。
　　 2、①GO及GO+PGZ組的3T3-L1脂肪細胞經(jīng)100mIU/L葡萄糖氧化酶處理4小時后，細胞內ROS水平較對照組增高(P<0.05)，GO+PGZ組與GO組相比，脂肪細胞內的ROS水平相比略低，但差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。
　　 ②GO及GO+PGZ組的3T3-L1脂肪細胞經(jīng)葡萄糖氧化酶處理后，SOCS-3mRNA及蛋白表達水平較對照組增高(P<0.05

12、)，GO+PGZ組SOCS-3增高程度低于GO組(P<0.05)。
　　 ③GO+PGZ組的3T3-L1脂肪細胞經(jīng)葡萄糖氧化酶處理后，細胞內脂聯(lián)素mRNA水平高于GO組(P<0.05)，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。
　　 三、結論
　　 1.細胞內ROS水平的增高可誘導3T3-L1成熟脂肪細胞中SOCS-3的表達增高，與此同時伴隨著脂聯(lián)素、抵抗素，TNF-α等脂肪因子表達的改變，推測這些變化共同構成氧化應激致

13、脂肪組織胰島素抵抗的分子機制的一部分，抗氧化劑α-硫辛酸可以明顯減輕ROS的作用，提示抗氧化治療可能通過部分抑制SOCS-3上調，發(fā)揮治療或預防胰島素抵抗的作用。
　　 2.PPARγ激動劑吡格列酮可部分抑制3T3-L1脂肪細胞在氧化應激情況下SOCS-3的表達上調，這一作用并不依賴于降低氧化應激時細胞內增高的ROS水平，推測吡格列酮可能通過促進脂聯(lián)素合成，或通過PPARγ激動以外的某種機制降低SOCS-3表達，從而發(fā)揮改善胰島