懸浮培養(yǎng)銀杏細(xì)胞產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的技術(shù)研究.pdf

1、銀杏葉中的黃酮類物質(zhì)具有廣泛的藥理作用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。因此實(shí)現(xiàn)銀杏細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮是保證今后市場(chǎng)需求的非常有希望的手段之一。本實(shí)驗(yàn)以銀杏未伸展的幼葉為外植體，建立起愈傷組織培養(yǎng)體系和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，并進(jìn)行了10L發(fā)酵罐培養(yǎng)，取得了較滿意的結(jié)果。 研究表明，銀杏葉片和葉柄在很多培養(yǎng)基上都能誘導(dǎo)出愈傷組織，葉片和葉柄在MS附加激素NAA1.0mg·L-1，6-BA1.0mg·L-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率分別達(dá)到100﹪和80﹪

2、，可以作為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。同時(shí)還得出結(jié)論，葉片的誘導(dǎo)效果要比葉柄的好。銀杏愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中很容易褐變，致使繼代培養(yǎng)無(wú)法進(jìn)行，加入3.0mg·L-1Vc可以很好的控制褐變。不同激素組合對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮類物質(zhì)合成有較大影響，3.00mg·L-1NAA+1.00mg·L-16-BA最有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮類物質(zhì)的合成，30天細(xì)胞增長(zhǎng)量達(dá)4.88g·瓶-1，黃酮合成量達(dá)11.20mg·g-1。實(shí)驗(yàn)得知，銀杏愈傷組織在固體培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮累

3、積均呈S型曲線，20天細(xì)胞鮮重達(dá)最大值，25天黃酮含量達(dá)最高。 在此基礎(chǔ)上，建立了葉來(lái)源的懸浮細(xì)胞體系。結(jié)果表明，1.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-16-BA的激素組合下，細(xì)胞鮮質(zhì)量增加最多，達(dá)3.64g·瓶-1，1.5mg·L-1NAA+1.0mg·L-16-BA處理下總黃酮含量最高，達(dá)11.01mg·g-1。培養(yǎng)基pH為6.0時(shí)，細(xì)胞增長(zhǎng)量和總黃酮含量都達(dá)到最大值，細(xì)胞生長(zhǎng)量3.96g·瓶-1，總黃酮含量10.08m

4、g·g-1。對(duì)于銀杏細(xì)胞來(lái)說(shuō)，細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮類物質(zhì)累積的最適蔗糖濃度均為35g·L-1。添加微量乙烯利(≤60mg·L-1)使細(xì)胞干重和黃酮類物質(zhì)積累都有提高，但提高乙烯利濃度，則無(wú)論細(xì)胞干重和總黃酮含量都迅速下降。茉莉酸甲酯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，添加一定濃度的茉莉酸甲酯可以使銀杏黃酮產(chǎn)量提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)第9天添加20μmol·L-1濃度的茉莉酸甲酯可以有效提高總黃酮產(chǎn)量而不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，其中總黃酮含量可達(dá)到1

5、0.93mg·L-1。 本文還探討了兩相培養(yǎng)對(duì)銀杏細(xì)胞產(chǎn)生黃酮類物質(zhì)的影響，以正十六烷為第二相，以二甲基亞砜作為產(chǎn)物釋放劑，正十六烷的加入對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)黃酮類物質(zhì)的合成有促進(jìn)作用，細(xì)胞干重隨著正十六烷含量的增加而減少，總黃酮產(chǎn)量隨著正十六烷含量的增加而增加，最高可達(dá)125.36mg·L-1。 利用10L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)培養(yǎng)銀杏細(xì)胞，裝液量為5L，pH為5.8時(shí)較有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和黃酮的積累，其細(xì)胞干重可達(dá)1