PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)大鼠心臟缺血再灌注損傷干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:近年來隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，許多新的醫(yī)療技術(shù)手段和方法在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，從冠脈內(nèi)單純球囊擴(kuò)張到藥物沈脫支架的應(yīng)用；從體外循環(huán)和停跳冠脈搭橋到微創(chuàng)無停跳搭橋；從單純心臟驟停后的心臟復(fù)蘇到心肺腦復(fù)蘇；從單一的腎臟移植到肝移植和胰腎聯(lián)合移植。這些進(jìn)步大大提高了臨床對(duì)疾病的治療效果和患者的預(yù)后，但同時(shí)也伴隨出現(xiàn)了大量器官缺血再灌注損傷(Ischemiareperfusioninjury，I/R)的病理生

2、理過程，常常導(dǎo)致治療效果不盡如人意甚至治療失敗。 心臟是對(duì)缺血缺氧耐受性較差的器官之一，是發(fā)生缺血再灌注損傷的最常見的器官，尤其是近年來冠脈內(nèi)介入技術(shù)的廣泛開展和心臟搭橋手術(shù)的不斷進(jìn)步使心臟缺血再灌注損傷的發(fā)生更為普遍。因此，如何減少缺血再灌注損傷的發(fā)生和減輕其造成的心臟損害是目前基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的重要課題。 氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)的重要機(jī)制之一，常導(dǎo)致自由基增加、細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)破壞、線粒體電位降低等，因此如何預(yù)

3、防再灌注損傷時(shí)的氧化應(yīng)激具有重要意義。輕度心肌缺血和再灌注后凋亡是心肌細(xì)胞主要的病理改變，而凋亡基因Bcl—2家族在凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中居于核心地位。PPAR—γ激動(dòng)劑羅格列酮(Rosiglitazone，ROS)是最早用于治療糖尿病的胰島素增敏劑，近期研究證明其也具有改善腦、腎和胰腺等器官缺血再灌注損傷的作用。 因此，觀察羅格列酮對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響并探討其可能的機(jī)制，為臨床心肌缺血再灌注損傷的防治提供新的思路是非常必要

4、的。 目的: 本研究旨在通過體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，模擬缺血再灌注損傷條件建立缺氧/復(fù)氧模型，觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞活性及凋亡的影響和羅格列酮的干預(yù)作用；觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Bcl—2基因和Bax基因的影響和羅格列酮的調(diào)控作用； 通過建立大鼠離體心臟Langendorff灌流模型觀察缺血再灌注損傷時(shí)大鼠心臟左室壓力、冠脈流量和心率的變化以及羅格列酮的干預(yù)作用；從病理組織學(xué)上分析羅格列

5、酮對(duì)心肌組織再灌注損傷的影響；觀察再灌注損傷時(shí)心肌Bcl—2和Bax的表達(dá)以及羅格列酮的調(diào)控作用。 通過細(xì)胞和組織水平的研究，探討羅格列酮是否能改善心臟缺血再灌注損傷及其具體機(jī)制，為心臟缺血再灌注損傷的防治提供新的思路和策略，并為PPAR—γ激動(dòng)劑在防治缺血再灌注損傷的臨床運(yùn)用提供新的理論依據(jù)。 方法: 第一部分： 觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)原代心肌細(xì)胞MDA(TBA法)、SOD(黃嘌呤氧化酶法)和LDH(2，4-

6、二硝基苯肼法)的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞活力和凋亡率的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；使用投射電鏡觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用。 第二部分： 利用Real—timePCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞抗凋亡基因Bcl—2mRNA和促凋亡基因BaxmRNA水平的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；利用Westernblot技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞Bcl

7、—2蛋白和Bax蛋白的變化以及羅格列酮的干預(yù)作用。 第三部分： 建立大鼠心臟Langendrof灌流模型，觀察I/R損傷對(duì)左心室壓力變化的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；觀察I./R損傷對(duì)大鼠心臟氧化應(yīng)激的影響和組織學(xué)變化以及羅格列酮的干預(yù)作用；利用Real—timePCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)技術(shù)觀察I/R損傷在器官水平上對(duì)心肌組織抗凋亡基因Bcl—2mRNA和促凋亡基因BaxmRNA水平和Bcl—2蛋白、Bax蛋白表達(dá)的

8、影響已經(jīng)羅格列酮的干預(yù)作用。 結(jié)果: 第一部分： DMSO—treated(I/R)組MDA和LDH水平明顯高于DMSO—treated組(P<0.05)，而SOD水平和細(xì)胞活力較DMSO—treated組降低(P<0.05)；ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組MDA和LDH水平較DMSO—treated(I/R)組顯著降低，而SOD水平

9、和細(xì)胞活力升高(P<0.05)； DMSO—treated(I/R)組細(xì)胞凋亡率顯著高于DMSO—treated組，而ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組細(xì)胞凋亡率較DMSO—treated(I/R)組降低(P<0.05)；以上指標(biāo)ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組也存在差異(P<

10、0.05)。ROS可以減輕心肌細(xì)胞凋亡小體的產(chǎn)生。 第二部分： Real—timeRT—PCR結(jié)果示：DMSO—treated(I/R)組Bcl—2mRNA的表達(dá)明顯低于DMSO—treated組和ROS—treated(20umol/L)組，而BaxmRNA的表達(dá)顯著高于該兩組(P<0.05)；ROS—treated(80umol/L)(I/R)組和DMSO—treated(I/R)組比較，Bcl—2mRNA水平增高而

11、BaxmRNA水平降低(P<0.05)； Westernblot結(jié)果顯示：DMSO—treated(I/R)組Bcl—的蛋白水平明顯低于DMSO—treated組和ROS—treated(20umol/L)組，而Bax蛋白水平顯著高于該兩組(P<0.05)；ROS—treated(80umol/L)(I/R)組和DMSO—treated(I/R)組比較，Bcl—2蛋白水平增高而Bax蛋白水平降低(P<0.05)； 第三部

12、分： 通過建立大鼠心臟Langendorff灌流模型，發(fā)現(xiàn)I/R組CF、HR和LVDP、+dp/dt較Sham組顯著降低，而LVEDP和—dp/dt較Sham組顯著增高(P＜0.05)；(ROS—treated)(3mg/kg)(I/R)組和I/R組相比CF、HR和LVDP、+dp/dt顯著增高，而LVEDP和—dp/dt顯著降低(P＜0.05)；ROS可以改善I/R損傷引起的MDA、LDH升高和SOD降低(P＜0.05)；RO

13、S可以改善缺血再灌注損傷引起的心肌組織學(xué)改變。 I/R組較Sham組Bcl—2mRNA水平降低而BaxmRNA水平增高(P＜0.05)；(ROS—treated)(3mg/kg)(I/R)組和I/R組相比，Bcl—2mRNA和Bcl—2蛋白水平升高而BaxmRNA和蛋白水平降低(P＜0.05)。 結(jié)論: 1)缺血再灌注損傷無論在細(xì)胞水平還是在器官水平均可引起心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，而PPAR—γ激動(dòng)劑羅格列酮具有減