PPAR-γ激動劑羅格列酮對大鼠心臟缺血再灌注損傷干預(yù)作用的實驗研究.pdf

1、研究背景:近年來隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展和醫(yī)療技術(shù)水平的不斷提高，許多新的醫(yī)療技術(shù)手段和方法在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，從冠脈內(nèi)單純球囊擴張到藥物沈脫支架的應(yīng)用；從體外循環(huán)和停跳冠脈搭橋到微創(chuàng)無停跳搭橋；從單純心臟驟停后的心臟復(fù)蘇到心肺腦復(fù)蘇；從單一的腎臟移植到肝移植和胰腎聯(lián)合移植。這些進步大大提高了臨床對疾病的治療效果和患者的預(yù)后，但同時也伴隨出現(xiàn)了大量器官缺血再灌注損傷(Ischemiareperfusioninjury，I/R)的病理生

2、理過程，常常導(dǎo)致治療效果不盡如人意甚至治療失敗。 心臟是對缺血缺氧耐受性較差的器官之一，是發(fā)生缺血再灌注損傷的最常見的器官，尤其是近年來冠脈內(nèi)介入技術(shù)的廣泛開展和心臟搭橋手術(shù)的不斷進步使心臟缺血再灌注損傷的發(fā)生更為普遍。因此，如何減少缺血再灌注損傷的發(fā)生和減輕其造成的心臟損害是目前基礎(chǔ)研究和臨床實踐的重要課題。 氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷發(fā)生時的重要機制之一，常導(dǎo)致自由基增加、細胞膜性結(jié)構(gòu)破壞、線粒體電位降低等，因此如何預(yù)

3、防再灌注損傷時的氧化應(yīng)激具有重要意義。輕度心肌缺血和再灌注后凋亡是心肌細胞主要的病理改變，而凋亡基因Bcl—2家族在凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中居于核心地位。PPAR—γ激動劑羅格列酮(Rosiglitazone，ROS)是最早用于治療糖尿病的胰島素增敏劑，近期研究證明其也具有改善腦、腎和胰腺等器官缺血再灌注損傷的作用。 因此，觀察羅格列酮對心肌缺血再灌注損傷的影響并探討其可能的機制，為臨床心肌缺血再灌注損傷的防治提供新的思路是非常必要

4、的。 目的: 本研究旨在通過體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，模擬缺血再灌注損傷條件建立缺氧/復(fù)氧模型，觀察缺氧/復(fù)氧對大鼠心肌細胞氧化應(yīng)激、細胞活性及凋亡的影響和羅格列酮的干預(yù)作用；觀察缺氧/復(fù)氧對大鼠心肌細胞Bcl—2基因和Bax基因的影響和羅格列酮的調(diào)控作用； 通過建立大鼠離體心臟Langendorff灌流模型觀察缺血再灌注損傷時大鼠心臟左室壓力、冠脈流量和心率的變化以及羅格列酮的干預(yù)作用；從病理組織學(xué)上分析羅格列

5、酮對心肌組織再灌注損傷的影響；觀察再灌注損傷時心肌Bcl—2和Bax的表達以及羅格列酮的調(diào)控作用。 通過細胞和組織水平的研究，探討羅格列酮是否能改善心臟缺血再灌注損傷及其具體機制，為心臟缺血再灌注損傷的防治提供新的思路和策略，并為PPAR—γ激動劑在防治缺血再灌注損傷的臨床運用提供新的理論依據(jù)。 方法: 第一部分： 觀察缺氧/復(fù)氧對原代心肌細胞MDA(TBA法)、SOD(黃嘌呤氧化酶法)和LDH(2，4-

6、二硝基苯肼法)的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；觀察缺氧/復(fù)氧對心肌細胞活力和凋亡率的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；使用投射電鏡觀察缺氧/復(fù)氧對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用。 第二部分： 利用Real—timePCR(實時熒光定量PCR)技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對心肌細胞抗凋亡基因Bcl—2mRNA和促凋亡基因BaxmRNA水平的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；利用Westernblot技術(shù)觀察缺氧/復(fù)氧對心肌細胞Bcl

7、—2蛋白和Bax蛋白的變化以及羅格列酮的干預(yù)作用。 第三部分： 建立大鼠心臟Langendrof灌流模型，觀察I/R損傷對左心室壓力變化的影響以及羅格列酮的干預(yù)作用；觀察I./R損傷對大鼠心臟氧化應(yīng)激的影響和組織學(xué)變化以及羅格列酮的干預(yù)作用；利用Real—timePCR(實時熒光定量PCR)技術(shù)觀察I/R損傷在器官水平上對心肌組織抗凋亡基因Bcl—2mRNA和促凋亡基因BaxmRNA水平和Bcl—2蛋白、Bax蛋白表達的

8、影響已經(jīng)羅格列酮的干預(yù)作用。 結(jié)果: 第一部分： DMSO—treated(I/R)組MDA和LDH水平明顯高于DMSO—treated組(P<0.05)，而SOD水平和細胞活力較DMSO—treated組降低(P<0.05)；ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組MDA和LDH水平較DMSO—treated(I/R)組顯著降低，而SOD水平

9、和細胞活力升高(P<0.05)； DMSO—treated(I/R)組細胞凋亡率顯著高于DMSO—treated組，而ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組細胞凋亡率較DMSO—treated(I/R)組降低(P<0.05)；以上指標ROS—treated(20umol/L)(I/R)組和ROS—treated(80umol/L)(I/R)組也存在差異(P<

10、0.05)。ROS可以減輕心肌細胞凋亡小體的產(chǎn)生。 第二部分： Real—timeRT—PCR結(jié)果示：DMSO—treated(I/R)組Bcl—2mRNA的表達明顯低于DMSO—treated組和ROS—treated(20umol/L)組，而BaxmRNA的表達顯著高于該兩組(P<0.05)；ROS—treated(80umol/L)(I/R)組和DMSO—treated(I/R)組比較，Bcl—2mRNA水平增高而

11、BaxmRNA水平降低(P<0.05)； Westernblot結(jié)果顯示：DMSO—treated(I/R)組Bcl—的蛋白水平明顯低于DMSO—treated組和ROS—treated(20umol/L)組，而Bax蛋白水平顯著高于該兩組(P<0.05)；ROS—treated(80umol/L)(I/R)組和DMSO—treated(I/R)組比較，Bcl—2蛋白水平增高而Bax蛋白水平降低(P<0.05)； 第三部

12、分： 通過建立大鼠心臟Langendorff灌流模型，發(fā)現(xiàn)I/R組CF、HR和LVDP、+dp/dt較Sham組顯著降低，而LVEDP和—dp/dt較Sham組顯著增高(P＜0.05)；(ROS—treated)(3mg/kg)(I/R)組和I/R組相比CF、HR和LVDP、+dp/dt顯著增高，而LVEDP和—dp/dt顯著降低(P＜0.05)；ROS可以改善I/R損傷引起的MDA、LDH升高和SOD降低(P＜0.05)；RO

13、S可以改善缺血再灌注損傷引起的心肌組織學(xué)改變。 I/R組較Sham組Bcl—2mRNA水平降低而BaxmRNA水平增高(P＜0.05)；(ROS—treated)(3mg/kg)(I/R)組和I/R組相比，Bcl—2mRNA和Bcl—2蛋白水平升高而BaxmRNA和蛋白水平降低(P＜0.05)。 結(jié)論: 1)缺血再灌注損傷無論在細胞水平還是在器官水平均可引起心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，而PPAR—γ激動劑羅格列酮具有減