Dynamin-1與內(nèi)側(cè)顳葉癲癇發(fā)生的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　癲癇(epilepsy)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，在兒童期發(fā)病率明顯高于其他年齡階段，發(fā)病率約為3.5‰～6.6‰，其發(fā)病形式多樣，病因復(fù)雜，對病人的危害巨大。其中難治性癲癇以內(nèi)側(cè)顳葉癲癇(mesialtemporal lobe epilepsy，MTLE)較為常見，海馬硬化為其突出的臨床病理特征。迄今為止，MTLE的治療一直是癲癇治療的難點(diǎn)，MTLE的發(fā)病機(jī)制仍是近幾十年來癲癇研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。
　　

2、近幾年來，關(guān)于突觸囊泡循環(huán)相關(guān)調(diào)控蛋白的研究已成為一個新的熱點(diǎn)。突觸囊泡循環(huán)是維持神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的基礎(chǔ)，突觸囊泡通過胞吐和胞吞作用完成一次突觸囊泡循環(huán)。大量研究證實(shí)，癲癇患者神經(jīng)元突觸有明顯的功能異常，這種病態(tài)突觸通過突觸囊泡的快速循環(huán)再生使正常情況下每秒僅能傳播數(shù)次或數(shù)十次神經(jīng)沖動的突觸傳遞功能增加到每秒數(shù)十次到數(shù)百次，使癇性放電得以迅速擴(kuò)布。深入研究囊泡的再循環(huán)細(xì)節(jié)以及生理調(diào)控的方式和位點(diǎn)，為臨床尋找有效治療靶點(diǎn)，具有重要的理論和實(shí)際

3、意義。
　　Dynamin-1，又稱發(fā)動蛋白-1，是一個96 kD的大分子量三磷酸鳥苷酶(GTPase)，為GTPase家族成員，近20年的研究從基因、細(xì)胞信號調(diào)控、蛋白功能等多方面已證實(shí)，dynamin-1在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的突觸囊泡胞吞及囊泡循環(huán)利用中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。非dynamin-1依賴的其他調(diào)控機(jī)制能夠維持生理狀態(tài)下基本正常的突觸囊泡胞吞功能，而dynamin-1在維持神經(jīng)元高頻、長時程放電過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，以

4、dynamin-1作為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，可以阻斷囊泡在高頻、長時程電興奮事件中的快速循環(huán)而發(fā)揮作用，而對生理狀態(tài)下的突觸傳遞活動影響甚少。由此可見，dynamin-1有希望成為一個非常有前景、完全不同于傳統(tǒng)抗癲癇藥物作用機(jī)制的抗癲癇新藥研發(fā)靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過建立幼年大鼠MTLE模型，從一個整體、連續(xù)發(fā)展的角度探討dynamin-1在MTLE發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化，同時在人MTLE患兒海馬組織中進(jìn)行驗(yàn)證。并進(jìn)一步建立離體原代海馬神

5、經(jīng)元癲癇細(xì)胞模型，探討dynamin-1在癲癇發(fā)生過程中的機(jī)制。從而為難治性MTLE尋找新的藥物靶點(diǎn)提供了一個全新的視角。
　　隨后，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建dynamin-14個結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，在大鼠腦神經(jīng)突觸小體中篩選出63個可能與dynamin-1存在相互作用的蛋白，并選取了3個以前從未報道過與dynamin-1有相互作用的蛋白:Rab GDI、C1C-3以TUC-4b，利用免疫共沉淀對其進(jìn)行自然條件下與dynamin-1相互作用的

6、研究。
　　本研究分為三部分:
　　研究方法:
　　1.利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法，用氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)3周齡Sprague-Dawley(SD)幼鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，根據(jù)MTLE發(fā)生發(fā)展過程取三個時間點(diǎn)（急性期、潛伏期、慢性期）一共分為6個組:急性期對照組、急性期模型組、潛伏期對照組、潛伏期模型組、慢性期自發(fā)發(fā)作組、慢性期對照組。運(yùn)用western blot及免疫組化技術(shù)動態(tài)觀察MTLE大鼠海馬組織中dynamin-1及

7、磷酸化dynamin-1蛋白的表達(dá)變化。并收集人難治性MTLE術(shù)后海馬標(biāo)本，western blot及免疫組化方法檢測其表達(dá)變化。
　　2.利用新生SD大鼠培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，應(yīng)用無鎂細(xì)胞外液灌流方法誘導(dǎo)癇性放電，建立癲癇細(xì)胞模型。應(yīng)用dynamin-1抑制劑dynasore抑制dynamin-1的活性，western blot及免疫熒光技術(shù)觀察癲癇細(xì)胞模型中dynamin-1及磷酸化dynamin-1蛋白的表達(dá)變化，并利用轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)

8、一步研究抑制dynamin-1蛋白活性后癲癇細(xì)胞模型胞吞量的改變。
　　3.構(gòu)建dynamin-14個功能結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，與大鼠腦突觸小體相互作用，利用GST-pull down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)篩選出dynamin-1在大鼠腦神經(jīng)突觸小體中的相互作用蛋白。驗(yàn)證2個已有報道中確切與dynamin-1存在相互作用的蛋白，endophilins以及amphiphysins。并選取3個以前從未報道過的dynamin-1相互作用的蛋白，Rab

9、 GDI、C1C-3以及TUC-4b，應(yīng)用免疫共沉淀對其進(jìn)行自然條件下與dynamin-1相互作用的研究。
　　研究結(jié)果:
　　1.Western blot及免疫組化結(jié)果顯示磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期及慢性期以及MTLE患兒海馬組織中表達(dá)較同時期對照組顯著降低(P＜0.05)，在MTLE大鼠潛伏期的表達(dá)與同時期對照組相比無差異。而dynamin-1總蛋白在MTLE大鼠各期、MTLE患兒及對照組海馬之間表

10、達(dá)無明顯差異。
　　2.Western blot及免疫組化結(jié)果顯示磷酸化dynamin-1蛋白在癲癇細(xì)胞模型組中表達(dá)較對照組顯著降低(P＜0.05)，經(jīng)dynamin-1抑制劑dynasore預(yù)處理的癲癇細(xì)胞模型組中磷酸化dynamin-1蛋白表達(dá)則與正常對照組基本一致，同時，dynasore對正常對照組磷酸化dynamin-1蛋白表達(dá)無明顯影響。Dynamin-1總蛋白在海馬神經(jīng)元癇性放電模型及對照組中表達(dá)無明顯差異。激光顯微共

11、聚焦顯示癲癇細(xì)胞模型組海馬神經(jīng)元胞吞量較正常對照組明顯增多(P＜0.05)。應(yīng)用dynasore抑制dynamin-1蛋白活性表達(dá)后，癇性放電組海馬神經(jīng)元胞吞量顯著減少。同時，dynasore對正常對照組海馬神經(jīng)元胞吞量無明顯影響。
　　3.本實(shí)驗(yàn)共篩選出63個可能與dynamin-1存在相互作用的蛋白，其中PRD域鑒定出36個蛋白，PH域14個蛋白，GED域7個蛋白，GTPase域6個蛋白。已知的dynamin-1相互作用蛋白e

12、ndophilins和amphiphysins被證實(shí)與dynamin-1存在相互作用關(guān)系。未報道蛋白RabGDI以及C1C-3與dynamin-1存在相互作用關(guān)系，然而，TUC-4b與dynamin-1之間未檢測出相互作用。
　　研究結(jié)論:
　　1.磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期、慢性期以及MTLE患兒海馬組織中表達(dá)較同時期對照組顯著降低，提示dynamin-1可能通過磷酸化/去磷酸化過程在癲癇發(fā)生發(fā)展過程

13、中發(fā)揮重要作用。
　　2.癲癇細(xì)胞模型組磷酸化dynamin-1蛋白表達(dá)下降，轉(zhuǎn)鐵蛋白胞吞量增多，但抑制dynamin-1活性后，其表達(dá)與正常對照組無明顯變化，同時正常對照組dynamin-1活性抑制前后磷酸化dynamin-1蛋白表達(dá)無明顯差異。提示dynamin-1可能通過影響其磷酸化/去磷酸化及調(diào)節(jié)突觸囊泡胞吞在癲癇發(fā)病機(jī)制中起重要作用，但對生理狀態(tài)下正常細(xì)胞表達(dá)無影響。
　　3.篩選了63個可能與dynamin-1存