人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T淋巴細(xì)胞增殖及IL-10、IFN-γ、LFA-1mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)可以減輕異基因造血干細(xì)胞移植(hematopietic stem cellstransplantation,HSCT)后的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。由于T淋巴細(xì)胞在GVHD的發(fā)生中起關(guān)鍵作用,故MSCs降低GVHD的因?yàn)榭赡転镸SCs抑制T淋巴細(xì)胞反應(yīng)

2、,但具體機(jī)制還不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)以植物血凝素(PHA)刺激人外周血淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)體系,觀察人BM-MSCs與人外周血T淋巴細(xì)胞接觸和非接觸培養(yǎng)時(shí)活化的變化,并通過(guò)檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ及LFA-1mRNA水平表達(dá),初步探討其機(jī)制,為今后BM-MSCs的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1人BMMSCs的培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定
　　 取營(yíng)養(yǎng)性貧血患者骨髓液10 ml,Fi

3、coll分離液分離后取中間細(xì)胞層,用含10％胎牛血清的F12-DMEM(1:1)培養(yǎng)液7ml,吹打混勻后接種于25cm2培養(yǎng)瓶中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48 h換液一次,后每2-3天換液1次。融合達(dá)80％-90％時(shí),胰酶消化,繼續(xù)傳代培養(yǎng)。取傳至第3代MSCs,消化離心收集細(xì)胞制成懸液。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD34、CD45、CD44表面抗原表達(dá)。
　　 2人外周血T淋巴細(xì)胞的分離、檢測(cè)、鑒定
　　

4、 取河北省血液中心提供的健康志愿獻(xiàn)血者外周血白細(xì)胞濾器,用生理鹽水反沖濾器獲得血細(xì)胞懸液,Ficoll分離液分離提取單個(gè)核細(xì)胞,NH4CL溶液裂解紅細(xì)胞,尼龍棉柱分離純化T淋巴細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3表達(dá)陽(yáng)性率。
　　 3 MSCs與T淋巴細(xì)胞分組混合培養(yǎng)
　　 3.1實(shí)驗(yàn)分組:
　　 A組:T淋巴細(xì)胞
　　 B組:T淋巴細(xì)胞+PHA
　　 C組:MSCs+T淋巴細(xì)胞

5、r>　　 D組:MSCs+T淋巴細(xì)胞+PHA
　　 E組:MSCs+T淋巴細(xì)胞(Transwell非接觸培養(yǎng))
　　 F組:MSCs+T淋巴細(xì)胞+PHA(Transwell非接觸培養(yǎng))
　　 3.2混合培養(yǎng)采用12孔板,每組設(shè)3復(fù)孔,取P3代MSCs,以7.5×104cells/孔的密度接種于C、D、E、F組,培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞貼壁,60Coγ射線5Gy照射去除細(xì)胞增殖分化能力。再將T淋巴細(xì)胞以2.5×106cel

6、ls/孔的密度(MSCs:T細(xì)胞=1:30)接種于各孔,以含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整總體積至3.5ml。向B、D、F組中加入PHA,終濃度為25μg/ml,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
　　 4各組T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定
　　 混合培養(yǎng)5天后,吸出各孔T淋巴細(xì)胞(Transwell培養(yǎng)組先混勻再吸出)約1.43×105個(gè)轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,MTT法測(cè)各孔吸光度OD值,每組實(shí)驗(yàn)

7、重復(fù)三次。計(jì)算抑制率=[(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD]×100％。
　　 5各組T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA測(cè)定
　　 提取各組T淋巴細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,熒光定量PCR方法測(cè)定IL-10、IFN-γ、LFA-1等細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量。引物序列(5'-3'):
　　 IL-10 forward:AGCTGTGGCCAGCTTGTTAT,reverse:TTCCATCTCCTGGGTTCAAG:<

8、br>　　 IFN-γforward:GGTTCTCTTGGCTGTTACTGCC,reverse:GGACATTCAAGTCAGTTACCGAAT;
　　 LFA-1 forward:GGTTTGGACGCTCCATCCAT,reverse:ACTGGGGGTAGAGAGACTTGAT;
　　 β-actin forward:CTGGCACCACACCTTCTACAAT,reverse:AATGTCACGCACGAT

9、TTCCCGC。
　　 6統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,多個(gè)樣本兩兩比較采用方差分析(Dunett’s T3),p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1 MSCs的培養(yǎng)8-10天后細(xì)胞形態(tài)均一,呈長(zhǎng)梭形,排列呈漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀。傳代細(xì)胞可保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征,增殖也較原代細(xì)胞迅速,流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,CD44表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,而CD34、CD45表達(dá)陰性,符合MSCs

10、免疫表型。
　　 2用反沖外周血白細(xì)胞濾器的方法再經(jīng)尼龍棉柱法分離純化可獲得足夠數(shù)量的T淋巴細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)拒染率大于95％,CD3+細(xì)胞大于80％,能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。
　　 3 MSCs細(xì)胞接種于12孔板貼壁后,60Co射線照射可去增殖。A組(T淋巴細(xì)胞)細(xì)胞均勻分布,增殖不明顯；D組(MSCs+T淋巴細(xì)胞+PHA)與F組(MSCs+T淋巴細(xì)胞+PHA Transwell非接觸培養(yǎng))淋巴細(xì)胞輕微聚集成團(tuán)生長(zhǎng)；而B(niǎo)組(T淋巴

11、細(xì)胞+PHA)淋巴細(xì)胞明顯聚集成團(tuán)生長(zhǎng),增殖較A、D、F組均旺盛。
　　 4 T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定:
　　 A組、C組(MSCs+T淋巴細(xì)胞)、E組(MSCs+T淋巴細(xì)胞 Transwell非接觸培養(yǎng))未加PHA,OD值與空白孔無(wú)差別(P>0.05)；而B(niǎo)組OD值高于D、F組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而F組高于D組、A組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),D組與A組差別無(wú)顯著性(P>0.05)其中D組T細(xì)胞抑制

12、率為75.4％,F組為43.7％,提示MSCs可以抑制PHA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖活性,且接觸培養(yǎng)較非接觸培養(yǎng)抑制作用明顯。
　　 5混合培養(yǎng)各組IL-10、IFN-γ、LFA-1 mRNA的測(cè)定:
　　 IL-10 mRNA的表達(dá)量D、F兩組比A、B兩組高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但A、B兩組差別無(wú)意義(P>0.05),D、F兩組差別也無(wú)意義(P>0.05)；IFN-γmRNA的表達(dá)量B組高于A、D、F組,差別

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而后三組表達(dá)量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示經(jīng)PHA可以刺激T淋巴細(xì)胞合成IFN吖mRNA,但不影響IL-10 mRNA的合成量,MSCs可以降低IFN-γmRNA的表達(dá)量,升高IL-10 mRNA的表達(dá)量,且這種作用并不依賴(lài)細(xì)胞的直接接觸。
　　 LFA-1是T淋巴細(xì)胞活化的標(biāo)志,mRNA水平間接反應(yīng)LFA-1表達(dá)情況,結(jié)果顯示:B組表達(dá)LFA-1 mRNA的量高于A、D、F組.差別有統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)意義(P<0.05),而后三組表達(dá)量差別無(wú)顯著性(P>0.05)。提示在PHA刺激下,T淋巴細(xì)胞合成LFA-1 mRNA增加,而MSCs也可以抑制這種反應(yīng),且并不依賴(lài)兩種細(xì)胞的直接接觸。
　　 結(jié)論:
　　 1 MSCs可以抑制PHA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖,并且接觸培養(yǎng)較非接觸培養(yǎng)抑制作用明顯。
　　 2 MSCs可以不依賴(lài)細(xì)胞之間的直接接觸,降低PHA刺激的Th1細(xì)胞因子IFN-γmRNA表達(dá)量,升高Th2胞因