紅芪多糖的純化與抗癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：紅芪多糖是傳統(tǒng)中藥紅芪 Hedysaym polybotrysr Hand．-Mazz．的主要藥用成分之一。隨著中藥多糖增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗腫瘤、抗輻射作用的發(fā)現(xiàn)，近年來，紅芪多糖也引起了愈來愈多的關(guān)注。前期的研究表明：紅芪總多糖具有抑瘤效應(yīng)和提高免疫功能的作用。由于紅芪多糖的結(jié)構(gòu)目前尚未闡明，故本研究通過對紅芪均一性多糖的結(jié)構(gòu)測定、抗腫瘤作用的比較和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理的探討，為闡明紅芪多糖抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)

2、，為挖掘潛在的抗腫瘤紅芪多糖提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)用尺寸排阻色譜對紅芪總多糖進(jìn)行分離純化，得到3種均一性紅芪多糖。用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍(lán)法、HPSEC、UV等分析方法對3種多糖的總糖、蛋白、均一性及分子量等理化指標(biāo)進(jìn)行了測定。(2)采用化學(xué)方法，包括：多糖全水解、甲基化分析及儀器分析方法，包括：GC，GC-MS，IR，NMR，ESI-MS等對紅芪多糖HPS-1和HPS-3的一級結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行測定。(3)MTT法測定3種紅

3、芪多糖及總多糖對2種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的影響。 (4)通過倒置顯微鏡、電鏡觀察和Hochest 33258熒光染色法觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測細(xì)胞周期變化：流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2、Fas和Caspase-3蛋白表達(dá)。 結(jié)果： (1)所得的3種紅芪多糖HPS-1，HPS-2和HPS-3的HPSEC譜中呈現(xiàn)單一對稱峰，表明其均為均一性多糖。3種多糖的理化性質(zhì)有一定的差異。 (2)紅芪多

4、糖HPS-1的分子量為9.4×10<'4>Da，組成的單糖僅為α-D-Glcp；HPS-2的分子量為6.4×10<'4>Da，組成的單糖為α-D-xylp，α-D-Galp 和α-D-Glcp，摩爾比為0.14：0.16：1.00；HPS-3的分子量為 1.7×10<'4>Da，單糖的組成為α-L-Rhap，α-D-Xylp，α-D-Galp和α-D-Glcp，摩爾比為0.04：0.19：0.19：1.00。在多糖的 NMR 譜，ESI

5、-MS譜中均出現(xiàn)了以上糖殘基的特征信號，IR譜中出現(xiàn)了a-Glcp的特征吸收峰。 (3)3種紅芪多糖及總多糖對體外培養(yǎng)的2種人腫瘤細(xì)胞增殖的影響具有很大差異；其中HPS-3的作用比較突出，有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且這種作用具有明顯的時效與量效關(guān)系。 (4)紅芪多糖HPS-3作用于MGC-803細(xì)胞后，可見明顯的凋亡細(xì)胞和凋亡峰，G<,2>/M期的細(xì)胞比例增高，凋亡率隨著藥物濃度的增加而加大，400μg/L 時的凋

6、亡率可達(dá)8.3±0.15％(P<0.01)；隨著HPS-3濃度的增加，細(xì)胞漿中Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)逐漸升高；但是Fas蛋白表達(dá)無明顯變化。 結(jié)論： (1) 紅芪多糖HPS-1是由(1→4)-α-D-Glcp和(1→6)-α-D-Glcp連接而成的葡聚糖；紅芪多糖HPS-3是一種主鏈由(1→6)-α-D-Glcp，(1→6)-α-D-Galp和α-D-Xylp-(1→重復(fù)片段構(gòu)成，支

7、鏈由β-D-Galp-(1→2)-α-L-Rhap殘基連接而成的水溶性雜多糖。 (2)3種紅芪多糖及總多糖具有不同的體外抗腫瘤作用，HPS-1對HEP-G2腫瘤細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，HPS-3對MGC-803腫瘤細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用。 (3)紅芪多糖的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，葡聚糖HPS-1和雜多糖HPS-3是極具潛力的抗腫瘤活性成分。 (4)HPS-3可阻滯細(xì)胞于G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此作用可能