荷載干細(xì)胞的TGF-β3-地塞米松-PLGA微球用于退變椎間盤的研究.pdf

1、背景：
　　椎間盤(The intervertebral disc，IVD)由層狀纖維環(huán)（annulus fibrosus，AF）包裹的髓核(nucleus pulposus，NP)構(gòu)成。髓核中有大量的椎間盤相關(guān)基質(zhì)蛋白，是由負(fù)電荷蛋白聚糖(proteoglycans，PG)和Ⅱ型膠原形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。椎間盤在許多情況下都會發(fā)生退變，臨床上極為常見，給國家醫(yī)療花費增加了沉重的負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有文獻(xiàn)證明，代謝因素如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix

2、 metalloproteinases，MMPs)，細(xì)胞凋亡，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子都會加速椎間盤的退變。目前臨床上針對椎間盤都以對癥治療為出發(fā)點，以減輕痛苦和修補功能為目標(biāo)，并沒有對椎間盤病變進行根治或是對其在生物力學(xué)功能上進行修復(fù)。對于椎間盤的修復(fù)，針對退變早期，新型的生物學(xué)治療方案是對椎間盤的基質(zhì)進行再生以及正常功能的全面恢復(fù)。體外研究顯示，TGF-β1，BMP-7，GDF-5和TGF-β3等生長因子會刺激椎間盤細(xì)胞的增殖及提高細(xì)胞外基

3、質(zhì)的合成能力。雖然一些研究提示GDF-5和BMP-7會椎間盤的退變產(chǎn)生抑制作用，但Walsh等的研究中，退變椎間盤的環(huán)狀纖維只有對大劑量TGF-β1的體內(nèi)注射產(chǎn)生即時效應(yīng)，這些生長因子在體內(nèi)短暫的半衰期成為阻礙生長因子治療效果的瓶頸。微創(chuàng)治療的微粒組裝系統(tǒng)不但可以作為細(xì)胞和蛋白質(zhì)緩釋載體，而且在可以用于各種微創(chuàng)組織工程研究。明確的生物組織相容性和安全性，使得PLGA微球作為組織相容復(fù)合物被廣泛應(yīng)用于各種各樣的生物組織工程研究。但是，培養(yǎng)

4、在PLGA微球上的椎間盤細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells，MSCs)，在常規(guī)培養(yǎng)基條件下常常從軟骨樣細(xì)胞表型的干細(xì)胞分化為成纖維樣細(xì)胞。因此，一些試驗都在嘗試著在椎間盤內(nèi)髓核組織分化中，將特殊的生長因子和藥物包裝到PLGA微球上。在材料表面修飾的過程中，納米顆粒在空間上可以被有序加工，用其制作的各式各樣新型材料已被用于光學(xué)，電學(xué)，磁學(xué)設(shè)備，此外，生物支架材料的表面修飾可以增加細(xì)胞表面的相互作用增強細(xì)胞功能。

5、值得一提的是，不同電荷的納米微粒的層層組裝(layer-by-layer assembly， LBL)已經(jīng)用于新型納米復(fù)合材料的制作，而且納米多層結(jié)構(gòu)材料也已經(jīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞移植。基于上述研究進展，本課題主要從以下五個方面進行了研究:(1)SD ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定;SD GFP/ADSCs和SD TGF-β3/ADSCs過表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定;(2)椎間盤微環(huán)境對不同年齡來源ADSCs的活力、增殖和基質(zhì)合成的影響;(3)

6、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球的制備及對SD ADSCs活性、增殖及分化能力的研究;(4) DEX/TGF-β3/PLGA納米微球/SD ADSCs復(fù)合物移植修復(fù)SD大鼠退變椎間盤的研究。
　　第一部分、SD ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定;SD GFP/ADSCs和SDTGF-β3/ADSCs過表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建和鑒定
　　目的：分離培養(yǎng)出SD大鼠ADSCs，然后通過三系分化和流式細(xì)胞術(shù)鑒定其干細(xì)胞特征。構(gòu)建攜帶TGF-

7、β3和GFP基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染到ADSCs，進而藥物篩選獲得GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs細(xì)胞系，同樣鑒定其干細(xì)胞特征，為椎間盤退變性疾病的細(xì)胞學(xué)及基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：我們首先采用機械剪碎組織，酶消化和貼壁法分離培養(yǎng)出SD大鼠ADSCs，通過研究干細(xì)胞形態(tài)，生長曲線，表面抗原標(biāo)記表達(dá)譜及三系分化能力，對分離的ADSCs進行鑒定。然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶TGF-β3和GFP基因的慢病毒

8、載體，轉(zhuǎn)染到ADSCs，進而藥物篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)TGF-β3和GFP基因的細(xì)胞系GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs。最后，本文按照干細(xì)胞形態(tài)，表面抗原標(biāo)記表達(dá)譜及三系分化能力，對細(xì)胞系GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs進行鑒定;同時利用RT-PCR和Western Blot檢測TGF-β3基因在三種細(xì)胞系A(chǔ)DSCs，GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs中的表達(dá)情況。體外成功建立SD大鼠ADSCs培養(yǎng)擴增的方法

9、，并成功誘導(dǎo)出成骨、成脂和成軟骨細(xì)胞。ADSCs造血干細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)為陰性，而間充質(zhì)干細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)為陽性?；蜣D(zhuǎn)染48h后觀察到較強的綠色熒光表達(dá)，Lenti-GFP-TGF-β3及Lenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90％以上。與GFP/ADSCs和ADSCs細(xì)胞相比，RT-PCR、Western blot檢測到目的基因TGF-β3在TGF-β3/ADSCs中出現(xiàn)過表達(dá)(P＜0.05)。此外，GFP/ADSCs和TGF-β3/ADS

10、Cs細(xì)胞系仍然具有干細(xì)胞特征。
　　結(jié)論：分離培養(yǎng)出的SD大鼠ADSCs體外培養(yǎng)擴增容易，具有多向分化潛能和間充質(zhì)干細(xì)胞特征。成功構(gòu)建了含有TGF-β3基因慢病毒載體，轉(zhuǎn)染ADSCs后，建立了GFP/ADSCs和TGF-β3/ADSCs細(xì)胞系。
　　第二部分、椎間盤微環(huán)境對不同年齡來源ADSCs的活力、增殖和基質(zhì)合成的影響
　　目的：人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)可能是椎間盤再生細(xì)胞的理想種子細(xì)胞，但惡劣微環(huán)境是否會

11、改變ADSCs生物活性和代謝活力，最終削弱它們的修復(fù)潛力。因此，本章主要研究人ADSCs在正常和退變椎間盤微環(huán)境條件下的活力，增殖能力及主要基質(zhì)蛋白的表達(dá)情況。
　　方法和結(jié)果：分別從兒童（年齡在8-12歲，n=6）和成人（年齡33-42歲，n=6）男性捐助者脂肪中培養(yǎng)ADSCs，然后把它們在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和模擬椎間盤微環(huán)境（低糖，酸性，高滲透壓和混合環(huán)境）的條件下培養(yǎng)2周。Annexin V-FITC(AV-PI)流式細(xì)胞術(shù)方法檢測

12、細(xì)胞生物活性，而細(xì)胞增殖率測定采用MTT法檢測。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot分析檢測蛋白多糖，膠原蛋白-Ⅰ和膠原蛋白-Ⅱ基因表達(dá)的情況。模擬椎間盤微環(huán)境的低糖培養(yǎng)條件不但可以保證ADSCs的活力和以較低的正常水平增殖，而且可以提高ADSCs合成蛋白聚糖的能力，所以我們推測椎間盤內(nèi)的低糖條件可能對ADSCs移植治療椎間盤退變是一個有利因素。相反，模擬椎間盤微環(huán)境的高滲透壓和低pH值微環(huán)境，損害ADSCs活

13、力，降低ADSCs增殖速度和基質(zhì)合成能力。此外，供體年齡差異對ADSCs的在椎間盤微環(huán)境中活力和增殖的影響甚微。
　　結(jié)論：對體外培養(yǎng)的ADSCs存活和增殖而言，低糖培養(yǎng)條件是其有利因素，而高滲透壓和酸性環(huán)境是其有害因素。這些研究結(jié)果有利于促進ADSCs用于下腰痛的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。
　　第三部分、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球的制備及對SD ADSCs活性、增殖及分化能力的研究
　　目的：這項研究旨在確定利用層層

14、組裝方法把肝素/多聚L-賴氨酸/生長因子與包埋地塞米松的PLGA微球上，然后評估該三維納米PLGA微球作為髓核組織工程支架的可行性。
　　方法和結(jié)果：我們的結(jié)果證明PLGA微球結(jié)構(gòu)可以在近似零級動力條件下同時釋放TGF-β3生長因子和地塞米松。經(jīng)過乳酸脫氫酶(LDH)檢測和CCK-8檢測得知，雙重緩釋的PLGA微球?qū)DSCs沒有細(xì)胞毒性，，其還可促進SDADSCs的增殖。體外4周培養(yǎng)后，PLGA微球組的ADSCs細(xì)胞的GAG/D

15、NA和Ⅱ型膠原表達(dá)顯著高于對照組。此外，定量實時PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PLGA微球組培養(yǎng)的ADSCs有較高水平的Ⅱ型膠原，聚集蛋白聚糖及多能聚糖的表達(dá)，但是成骨分化標(biāo)記物（Ⅰ型膠原）含量較低。
　　結(jié)論：綜上，DEX/TGF-β3/PLGA微球可應(yīng)用于髓核組織工程中，不但作為支架促進ADSCs細(xì)胞生長并促進向髓核樣細(xì)胞進化，而且降低局部微環(huán)境的炎癥反應(yīng)。
　　第四部分、DEX/TGF-β3/PLGA納米微球/SD A

16、DSCs復(fù)合物移植修復(fù)SD大鼠退變椎間盤的研究
　　目的：下腰痛常常是由椎間盤髓核退變引起的。組織工程是一個功能強大的治療模式，其以恢復(fù)人脊柱正常的生物力學(xué)運動功能為目的。第三章我們報道了一個新的納米結(jié)構(gòu)的3D PLGA微球，體外研究發(fā)現(xiàn)，這種通過層層組裝地塞米松和生長因子到3D PLGA微球，可以控釋兩種生物活性因子，是一種優(yōu)良的髓核組織工程的細(xì)胞載體。本章研究的目的是調(diào)查移植3D PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物到大鼠椎間盤退

17、變模型，是否可以再生退化的椎間盤。
　　方法和結(jié)果：大鼠共分為四組:正常對照組（NC組，無操作），退交對照組(DC組，針刺操作)，PLGA微球治療組（PM組，針刺操作+PLGA微球移植），PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物治療組（PMA組，針刺操作+PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物移植）。分別在移植后的第4、8、16和24周，對四組大鼠椎間盤行X先平片檢測椎間盤高度的變化，T2加權(quán)磁共振成像(MRI)檢查，組織學(xué)染色和評分，免疫組化

18、和RT-PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，移植24周后，以NC組為正常參照，PM和PMA組的椎間盤平均高度值分別約為63％和76％，MRI信號強度分別約47％和76％。生物化學(xué)，免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)分析表明在PM和PMA組椎間盤有較多的蛋白多糖積累。
　　結(jié)論：這些數(shù)據(jù)表明，在大鼠椎間盤退變模型中，移植3D PLGA微球荷載ADSCs復(fù)合物能在一定程度再生退化的椎間盤。PLGA微球在細(xì)胞移植治療椎間盤退變性疾病可能會是一種很