新型炎癥相關(guān)基因CNT2b的發(fā)現(xiàn)、克隆及功能初探.pdf

1、炎癥和免疫反應(yīng)是一種常見的病理過程，大多數(shù)的人類疾病均與此有關(guān)。除了人們所熟知的感染性疾病外，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝纖維化、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、阿爾茨海默病以及惡性腫瘤等多種疾病也與炎癥密切相關(guān)。炎癥免疫因素參與了這些疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸整個過程。巨噬細胞是機體免疫系統(tǒng)的一種重要細胞，不僅具有很強的吞噬功能，而且是主要的抗原提呈細胞，在多種炎癥和免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用?；罨木奘杉毎煞置诙喾N生物活性物質(zhì)，如一

2、氧化氮、白介素.1、腫瘤壞死因子α、活性氧以及前列腺素、白三烯等花生四烯酸代謝產(chǎn)物。誘生型環(huán)氧酶(cyclooxygenase，COX)-COX-2可大量表達于巨噬細胞中。種種研究跡象表明，COX-2并非專一性地參加炎癥反應(yīng)，還在保護胃粘膜、維護腎臟功能、學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮重要作用，可能還存在其它亞型。眾多的炎癥因子在炎癥反應(yīng)的不同時期組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，相互作用，共同調(diào)控炎癥反應(yīng)的的進程和預(yù)后。巨噬細胞在炎癥免疫反應(yīng)中所起的重要作用，且其

3、在誘導(dǎo)狀態(tài)下能大量表達COXs，因此我們擬針對COX的保守序列設(shè)計簡并引物，選擇急性炎癥誘導(dǎo)下的巨噬細胞cDNA作為模板克隆新型COX亞型或炎癥相關(guān)性基因，并對其表達特征和功能進行初步研究。 方法: 1.分析不同物種、不同亞型的COX的保守序列，設(shè)計簡并引物。 2.采用腹腔注射酵母多糖A的方法建立SD大鼠急性腹膜炎模型，采集腹腔巨噬細胞，提取總RNA，進行RT-PCR，擴增產(chǎn)物純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5a細菌，

4、抽提質(zhì)粒，測序。 3.選取新型序列，進行3’，5’快速末端反應(yīng)，獲取全長基因序列。 4.采用Realtime RT-PCR法分別檢測新基因CNT2 mRNA、CNT2b mRNA在大鼠不同臟器組織中的表達情況，以及在酵母多糖誘導(dǎo)的急性腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中表達的時相特征。 5.應(yīng)用Realtime RT-PCR法觀察抗炎藥物阿司匹林(12mg/kg)、塞來昔布(0.13mg/kg)和潑尼松(0.4mg/kg)對

5、大鼠腹腔巨噬細胞中CNT2b mRNA和CNT2 mRNA表達的影響。 6.針對CNT2b序列設(shè)計siRNA干擾序列，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)NR8383大鼠巨噬細胞；Realtime RT-PCR法檢測干擾后細胞中炎癥相關(guān)因子IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、IL-10以及CNT2、CNT2b等分子的mRNA表達情況。 結(jié)果: 1.不同物種的COX-1、COX-2和COX-3序列中存在兩段

6、氨基酸保守序列。 2.從大鼠腹腔巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)并克隆了一個新基因，全長13330nt，為—mRNA序列，對應(yīng)DNA位于大鼠第三號染色體3q35區(qū)。經(jīng)BLAST分析與序列比對，該基因與Na+依賴性核苷轉(zhuǎn)運載體(Na+/nucleoside cotransporter，CNT)2有較高同源性，保留了CNT2的第1、7～14、16、17內(nèi)含子；并且，在CNT2的最后一個(第18個)外顯子后，又附加了一段3169nt長的序列。由于該基因

7、和CNT2均包含加尾信號和polyA尾巴，均為完整的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，故確定為CNT2的剪接異構(gòu)體，已提交Genbank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號：EU032627.2，重新命名為CNT2b。 3.CNT2 mRNA在全身各器官均有表達，其中在心臟、肝臟、平滑肌、脾臟表達較高；CNT2b mRNA在正常器官中表達量遠遠少于CNT2 mRNA，其中心臟、平滑肌、肝臟表達稍高。 4.CNT2b mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中的表達具有顯

8、著時相特征。注射酵母多糖后，其表達顯著升高，至2h時達到最高點；隨后，表達量逐漸降低，至24h時基本恢復(fù)至0.5h時的水平；致炎后36h，表達量再次明顯升高，至第48h時又降至36h時的47.52％。CNT2 mRNA在腹膜炎大鼠腹腔巨噬細胞中的表達也具有類似特征，其時相變化幅度遠少于CNT2b mRNA。 5.三種抗炎藥物阿司匹林、潑尼松、塞來昔布均能明顯降低CNT2b mRNA表達量。在臨床使用劑量下，潑尼松作用最強，阿司匹

9、林次之，塞來昔布最弱。 6.抑制CNT2b基因表達后NR8383細胞中IL-1βmRNA，IL-6 mRNA，TNF-αmRNA，COX-2 mRNA的表達均顯著升高，IL-10 mRNA的表達明顯降低。 結(jié)論: 1.在大鼠腹腔巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)并克隆了一個新基因CNT2b。 2.CNT2b屬于炎癥誘導(dǎo)性高表達基因，在正常組織中很少表達，而在急性炎癥刺激的巨噬細胞中表達顯著增加。在大鼠急性腹膜炎過程中，腹腔巨