人下頜下腺干-祖細胞分離培養(yǎng).pdf

1、目的：本課題通過體外分離、培養(yǎng)來源于胎兒下頜下腺的干/祖細胞，并對其表面標記及生物學特征進行研究。為進一步將這些干/祖細胞誘導分化為內胚層來源的腺體功能細胞（胰腺、肝臟、唾液腺）的實驗研究打下基礎。 方法：①機械法+酶消化法進行人胎兒下頜下腺來源細胞的分離、純化，然后進行原代培養(yǎng)。②體外選擇性培養(yǎng)胎兒原代下頜下腺細胞形成的集落，獲得下頜下腺類上皮細胞集落。經選擇性消化該集落，有限稀釋法純化獲得下頜下腺類上皮單克隆細胞，并將其命名

2、為（human Submandibular Gland Progenitor cells，hSGPs）。③繪制hSGPs生長曲線，觀察其增殖情況。④進行CK19、Laminin免疫熒光染色；流式細胞學檢測膜蛋白表面標記CD29、Thy-1（CD90．1）和c-Kit（CD117）。⑤對長期培養(yǎng)的hSGPs進行核型分析，了解其染色體形態(tài)、結構及數量。 結果：①通過機械十酶消化法獲得的hSMGs主要為三角形、多邊形和不規(guī)則細胞，包括

3、少量類腺泡上皮細胞。在培養(yǎng)12天后見3個生長明顯的細胞集落形成。②將原代形成的細胞集落選擇性消化傳代培養(yǎng)，9天后見1個集落呈鋪路石樣排列，細胞形態(tài)單一，核漿比例大。繼而選擇性消化該集落，經有限稀釋法得到由一個細胞增殖而來的人下頜下腺類上皮單克隆細胞。③生長曲線測定顯示第6代hSGPs接種后第1天即開始增殖，第2天進入對數生長期，持續(xù)至第7日細胞增殖能力開始減弱，但仍保持緩慢上升趨勢，未顯示明顯的平臺期。hSGPs群體倍增時間為36小時；

4、延遲時間為33．6小時。④免疫熒光染色：hSGPs表達CK19、層粘連蛋白（laminin）：流式細胞術檢測：Thy-1（99．69％）、CD29（98．83％）、c-Kit（67．27％）。⑤G顯帶核型分析：hSGPs染色體數2n=46，其中常染色體22對，性染色體1對；hSGPs染色體數目、形態(tài)及結構未發(fā)現異常改變。 結論：我們培養(yǎng)獲得的hSGPs具有高粘附、高增殖和體外克隆能力強等組織干細胞特性，體外長期傳代培養(yǎng)保持二倍體