人下頜下腺干-祖細(xì)胞分離培養(yǎng).pdf

1、目的：本課題通過體外分離、培養(yǎng)來源于胎兒下頜下腺的干/祖細(xì)胞，并對(duì)其表面標(biāo)記及生物學(xué)特征進(jìn)行研究。為進(jìn)一步將這些干/祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)胚層來源的腺體功能細(xì)胞（胰腺、肝臟、唾液腺）的實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。 方法：①機(jī)械法+酶消化法進(jìn)行人胎兒下頜下腺來源細(xì)胞的分離、純化，然后進(jìn)行原代培養(yǎng)。②體外選擇性培養(yǎng)胎兒原代下頜下腺細(xì)胞形成的集落，獲得下頜下腺類上皮細(xì)胞集落。經(jīng)選擇性消化該集落，有限稀釋法純化獲得下頜下腺類上皮單克隆細(xì)胞，并將其命名

2、為（human Submandibular Gland Progenitor cells，hSGPs）。③繪制hSGPs生長曲線，觀察其增殖情況。④進(jìn)行CK19、Laminin免疫熒光染色；流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)膜蛋白表面標(biāo)記CD29、Thy-1（CD90．1）和c-Kit（CD117）。⑤對(duì)長期培養(yǎng)的hSGPs進(jìn)行核型分析，了解其染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)及數(shù)量。 結(jié)果：①通過機(jī)械十酶消化法獲得的hSMGs主要為三角形、多邊形和不規(guī)則細(xì)胞，包括

3、少量類腺泡上皮細(xì)胞。在培養(yǎng)12天后見3個(gè)生長明顯的細(xì)胞集落形成。②將原代形成的細(xì)胞集落選擇性消化傳代培養(yǎng)，9天后見1個(gè)集落呈鋪路石樣排列，細(xì)胞形態(tài)單一，核漿比例大。繼而選擇性消化該集落，經(jīng)有限稀釋法得到由一個(gè)細(xì)胞增殖而來的人下頜下腺類上皮單克隆細(xì)胞。③生長曲線測(cè)定顯示第6代hSGPs接種后第1天即開始增殖，第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，持續(xù)至第7日細(xì)胞增殖能力開始減弱，但仍保持緩慢上升趨勢(shì)，未顯示明顯的平臺(tái)期。hSGPs群體倍增時(shí)間為36小時(shí)；

4、延遲時(shí)間為33．6小時(shí)。④免疫熒光染色：hSGPs表達(dá)CK19、層粘連蛋白（laminin）：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)：Thy-1（99．69％）、CD29（98．83％）、c-Kit（67．27％）。⑤G顯帶核型分析：hSGPs染色體數(shù)2n=46，其中常染色體22對(duì)，性染色體1對(duì)；hSGPs染色體數(shù)目、形態(tài)及結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常改變。 結(jié)論：我們培養(yǎng)獲得的hSGPs具有高粘附、高增殖和體外克隆能力強(qiáng)等組織干細(xì)胞特性，體外長期傳代培養(yǎng)保持二倍體