細(xì)胞分化調(diào)控對(duì)皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)與再生作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：研究不同發(fā)育階段皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)的抗原表達(dá)，以及細(xì)胞分化對(duì)皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)損傷的修復(fù)作用。 方法：取不同發(fā)育階段的胎兒和成人皮膚，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)皮膚及其附屬結(jié)構(gòu)的抗原表達(dá)。體外分離培養(yǎng)人成體MSCs和SGCs，檢測(cè)MSCs和SGCs的抗原表達(dá)、以及MSCs的分化能力；分別用BrdU或DAPI標(biāo)記MSCs；將融合的SGCs(2～4×105)，經(jīng)47℃高溫處理造成體外熱損傷休克模型，再加入標(biāo)記的1～2×105MSCs共同

2、培養(yǎng)，7d后，檢測(cè)MSCs的表型、表型轉(zhuǎn)化率和MSCs表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中的信號(hào)機(jī)制，以及不同因素對(duì)MSCs表型轉(zhuǎn)化的影響；將培養(yǎng)并標(biāo)記的大鼠MSCs經(jīng)靜脈輸注到全層皮膚切割傷的同種大鼠體內(nèi)，分別在輸注后3d、14d和28d檢測(cè)皮膚和股骨部位的標(biāo)記細(xì)胞和這些細(xì)胞的表型改變。包皮皮片去除脂肪后，用蛋白水解酶消化分離表皮，分離的表皮片用Ⅳ型膠原反復(fù)粘貼并沖洗以去除表皮干細(xì)胞。處理后的表皮片用DAPI標(biāo)記后移植到全層皮膚切割傷的BALB/c裸鼠，并

3、局部外用細(xì)胞生長(zhǎng)因子，7d后用免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞儀法檢測(cè)移植后存活表皮細(xì)胞的表型改變。 結(jié)果：汗腺表達(dá)CK7、CK8、CK14、CK18、CK19和CEA，毛囊表達(dá)CK7、CK14和CK19，皮脂腺表達(dá)CK8和CK14，皮膚基底層表達(dá)CK19和CK14，角質(zhì)層表達(dá)CK10。MSCs和SGCs均呈克隆樣生長(zhǎng)；MSCs表達(dá)CD29、CD44、CD71、CD105和CD166，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45，以及汗腺標(biāo)志

4、CK19和CEA，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后MSCs可以向骨和脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化；BrdU或DAPI均標(biāo)記MSCs的細(xì)胞核，BrdU標(biāo)記率為74％，DAPI可達(dá)90％以上；培養(yǎng)的SGCs表達(dá)CK7、CK8、CK18、CK19和CEA；SGCs經(jīng)高溫?fù)p傷后，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞問(wèn)連接消失；MSCs和損傷的SGCs共培養(yǎng)7d后，部分MSCs表達(dá)CK19/CEA汗腺細(xì)胞標(biāo)志；EGF和損傷微環(huán)境促進(jìn)MSCs向SGCs表型轉(zhuǎn)化，而PD98059抑制這種表型轉(zhuǎn)化，ER

5、K和pERK信號(hào)通路參與了MSCs向SGCs的表型轉(zhuǎn)化。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)同種異體大鼠MSCs移植后14d，創(chuàng)面附近的毛囊、皮脂腺、血管和真皮均有BrdU+細(xì)胞摻入，而且，毛囊和皮脂腺BrdU+細(xì)胞同時(shí)表達(dá)廣譜角蛋白；移植后28d，骨髓腔中出現(xiàn)BrdU+細(xì)胞，部分真皮仍然保留有BrdU+細(xì)胞。用Ⅳ型膠原反復(fù)粘貼并沖洗的包皮皮片CK19和β1整合素染色陰性；移植后7d，部分皮片柔軟、紅潤(rùn)，部分皮片干硬呈黑色，皮片存活率為58.3％；存活皮片CK