STAT5誘騙核苷酸對(duì)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜芯片分析.pdf

1、第一章cDNA芯片篩選STAT5誘騙核苷酸作用 K562細(xì)胞后的凋亡差異基因 目的：轉(zhuǎn)錄因子STAT5在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中組成性激活，并與CML細(xì)胞惡性表型密切相關(guān)。本研究用cDNA芯片技術(shù)探討誘騙核苷酸(decoyODNs)抑制STAT5對(duì)白血病K562細(xì)胞株凋亡相關(guān)基因的影響。 方法：分別提取decoyODNs處理前后的K562細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成Cy3、Cy5標(biāo)記的cDNA探針，與人14K基因

2、表達(dá)譜cDNA芯片(V2.0)雜交，掃描獲得數(shù)據(jù)后，用Genespring軟件分析對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的差異表達(dá)基因，半定量RT-PCR驗(yàn)證cDNA芯片部分結(jié)果。 結(jié)果：2張cDNA芯片檢測(cè)重復(fù)性良好(R=0.9799)。在13824個(gè)標(biāo)記的基因中，檢出413個(gè)上調(diào)基因，其中包括：TIAFl、GABl、GYPA、DAPK3、TNFRSFlB、IRFl和PML等在內(nèi)的18個(gè)凋亡相關(guān)基因；在檢出的332個(gè)下調(diào)基因中，發(fā)現(xiàn)PIM1、CCND

3、2、CCND1、MYC和BCL2L1等在內(nèi)的11個(gè)凋亡相關(guān)基因；選擇其中IRF1、PML、pim1和c-myc基因經(jīng)半定量RT-PCR證實(shí)與cDNA芯片結(jié)果一致。 結(jié)論：decoyODNs抑制STAT5后可引起K562細(xì)胞多種凋亡相關(guān)基因的變化，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究STAT5信號(hào)通路所調(diào)控的凋亡相關(guān)基因提供了依據(jù)。 第二章PML基因?qū)562細(xì)胞增殖和凋亡的作用 目的：在前一部分的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)cDNA芯片技術(shù)篩選了

4、decoyODN轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞前后與STAT5相關(guān)的凋亡差異表達(dá)基因。其中PML基因差異表達(dá)比率相對(duì)較高，且PML基因具有多重生物學(xué)活性，因此，本部分主要研究PML在K562細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：按照RNA干擾(RNAi)設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PML基因不同序列的3條siRNA，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs進(jìn)入K562細(xì)胞，分別用RT-PCR和westernblot檢測(cè)siRNAs對(duì)PML基因mRNA和蛋白

5、質(zhì)表達(dá)的影響，從而篩選出抑制效率最佳的siRNA序列；然后設(shè)計(jì)單堿基突變的對(duì)照序列，以證實(shí)siRNA單堿基突變也會(huì)喪失對(duì)PML基因的封閉作用。并用流式細(xì)胞術(shù)(CMF)檢測(cè)K562細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡情況。 結(jié)果：RT-PCR和westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，3條候選siRNA序列中，PML-si2和PML-si3處理組PML基因mRNA分別降低了80.4％和33.5％，與其他組比較均有顯著性差異P＜0.05)；PML-s

6、il、PML-si2和PML-si3對(duì)PML蛋白表達(dá)抑制率分別為1.4％±O.12％、87％±0.06％和65％±0.04％，其中PML-si2的抑制率最高，與其他組相比有顯著差異(P＜O.01)，而其點(diǎn)突變序列PML-si2-mut不能夠抑制PML基因的表達(dá)。細(xì)胞增殖、周期和凋亡的檢測(cè)結(jié)果顯示：PML-si2處理組48h后K562細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)，細(xì)胞周期中S期細(xì)胞明顯增多和G0/G1期細(xì)胞明顯減少，提示PML對(duì)K562細(xì)胞有抑制增