外源性導(dǎo)入抑癌基因FHIT對肝癌細(xì)Hep3B生長的影響.pdf

1、目的 脆性組氨酸三聯(lián)體基因(fragilehistidinetriadgene，F(xiàn)HIT)作為抑癌基因與肝癌的發(fā)生有關(guān)，且在肝癌細(xì)胞系Hep3B中存在FHIT基因染色體、mRNA和蛋白的異常。本研究擬探討外源性人FHIT的高表達(dá)對人肝癌細(xì)胞Hep3B生長的影響。 材料和方法 1.用免疫組織化學(xué)S-P法檢測46例肝癌及相應(yīng)癌旁組織中脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因蛋白的表達(dá)，標(biāo)本均為2001～2003年同濟(jì)醫(yī)院病理

2、科存檔外科手術(shù)標(biāo)本。其中男34例女12例，平均年齡56.3歲(18～72歲)。腫瘤平均直徑(6.4±3.1)cm，其中≤5cm有9例，＞5cm有37例；甲胎蛋白＞20ug/1有42例，≤20ug/1有4例；合并乙型肝炎病毒感染的有40例，未感染者6例；所有腫瘤標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)屬高分化者14例，中分化者20例，低分化者12例；有包膜的5例，無包膜的41例；經(jīng)手術(shù)證實(shí)有門靜脈癌栓8例(均屬低分化型)，無癌栓38例；合并肝硬化35例，無肝硬化1

3、1例。另選10例因膽道手術(shù)切除的部分正常肝組織為正常對照組織。參考近期國外文獻(xiàn)方法觀察FHIT蛋白的陽性強(qiáng)度和陽性率，采用χ2檢驗(yàn)分析FHIT表達(dá)與臨床資料的相互關(guān)系。另采用免疫組織化學(xué)S-P法和圖像分析技術(shù)檢測了46例人肝癌組織及癌旁組織和10例正常肝組織中FHIT和PTEN基因蛋白的表達(dá)。探討脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因和PTEN基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(簡稱肝癌)中的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系。 2.構(gòu)建一個(gè)包含人脆性組

4、氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/FHIT，體外轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Hep3B，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Western印跡法分別檢測目的基因不同水平的表達(dá)，通過細(xì)胞生長試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀分析技術(shù)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。 3.裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)：用Lipofectamine2000介導(dǎo)將2μgpcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)/FHIT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hep

5、3B細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48h用G418(500mg/L)進(jìn)行篩選14天，可見有抗性克隆形成，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)獲得混和克隆，用此混和克隆細(xì)胞進(jìn)行裸鼠背部皮下注射，試驗(yàn)分2組，每組6只裸鼠，用于接種轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/FHIT質(zhì)粒和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)的Hep3B細(xì)胞，每只接種細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，觀察各組試驗(yàn)動(dòng)物成瘤情況。于接種后每隔3天觀察一次腫瘤的大小，21天后處死動(dòng)物，剝離腫瘤，測量腫瘤大小并稱瘤重，根據(jù)公式V=π/6W2×

6、L(W為寬度，L為長度)計(jì)算瘤體積，以接種轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組為對照，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果 1.10例正常肝組織中FHIT基因表達(dá)均呈強(qiáng)陽性(10/10，100.00％)，46例癌旁組織FHIT蛋白表達(dá)呈不同程度陽性：陽性17例(36.96％)；強(qiáng)陽性29例(63.04％)。正常肝組織與癌旁組織中均無FHIT蛋白的丟失。46例肝癌組織中20例(43.48％)FHIT蛋白丟失(表達(dá)陰性)，20例表達(dá)為陽性(43.48％

7、)，6例表達(dá)為強(qiáng)陽性(13.04％)。肝癌組織中FHIT基因表達(dá)水平與肝癌大小、甲胎蛋白高低、是否有無包膜、是否合并乙肝病毒感染及肝硬化無明顯關(guān)系；而與腫瘤組織分化有密切關(guān)系(χ2=6.619;P=0.045)，與是否有門靜脈癌栓也有關(guān)(χ2=4.336;P=0.037)。46例肝癌組織中FHIT和PTEN蛋白免疫組化陽性反應(yīng)顆粒的平均光密度分別為(0.1339±0.3864，0.1534±0.1562)，均明顯低于相應(yīng)癌旁組織(0.2

8、051±0.5372，0.3271±0.2371)和正常組織(0.2289±0.7589，0.3753±0.0519)的水平(P＜0.05)；FHIT、PTEN與肝癌的病理分級、合并門靜脈癌栓有密切關(guān)系。 2.質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/FHIT構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/FHIT后，Hep3B-FHIT細(xì)胞FHIT-mRNA陽性，為400bp條帶，而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hep3B-C和親本細(xì)胞Hep3B未見此條帶的表達(dá)；H

9、ep3B-FHIT細(xì)胞中有17kD的FHIT蛋白表達(dá)，而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hep3B-C和親本細(xì)胞Hep3B未見FHIT蛋白表達(dá)；FHIT基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hep3B-FHIT較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞Hep3B-C和親本細(xì)胞Hep3B的生長速度明顯減慢，尤其是達(dá)到對數(shù)生長期后更加明顯，差異有顯著性(P＜0.05)；流式細(xì)胞結(jié)果表明Hep3B-FHIT細(xì)胞G2/M期及S期比例明顯下降，G0/G1期比例明顯增加，凋亡細(xì)胞率也明顯高于對照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(P＜

10、0.05)。 3.動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有試驗(yàn)動(dòng)物均有大小不等的腫瘤生成，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)/FHIT的細(xì)胞所形成的腫瘤重量和體積分別為(0.398±0.244)g和(408±268)mm2，而轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)的細(xì)胞所形成的腫瘤重量和體積分別為(0.763±0.193)g和(829±271)mm2，兩組相比差異均有顯著性(t檢驗(yàn)，p分別為0.017和0.022)。 結(jié)論 1.FHIT基因蛋白

11、在正常肝組織及癌旁組織均為陽性表達(dá)，顯著高于在肝癌中的陽性表達(dá)。FHIT基因蛋白的丟失與腫瘤是否有門靜脈癌栓、腫瘤組織分化程度明顯相關(guān)，與腫瘤大小、有無包膜、甲胎蛋白是否陽性、是否感染乙型肝炎病毒、是否合并肝硬化等因素均無明顯的相關(guān)性。FHIT基因蛋白缺失在肝癌組織中是頻發(fā)事件。FHIT基因蛋白在肝癌中缺失與肝癌臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系，尚須大量研究證實(shí)。另FHIT和PTEN基因蛋白缺失在肝癌組織中是頻發(fā)事件。FHIT和PTEN與肝癌的病理