Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞線粒體依賴性凋亡與鈣穩(wěn)態(tài)失衡的研究.pdf

1、目的： 通過體外試驗(yàn)，初步探討六價(jià)鉻（hexavalent chromium，Cr（Ⅵ））誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞凋亡與鈣穩(wěn)態(tài)失衡之間的關(guān)系及相互作用機(jī)制。 方法： 以Hep3B肝癌細(xì)胞為受試細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)分別檢測(cè)Cr（Ⅵ）、線粒體保護(hù)劑（DZ）及鈣離子螯合劑（BAPTA/AM）單獨(dú)及其與共處理對(duì)Hep3B細(xì)胞存活率的影響，通過單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞DNA損傷情況，篩選出Cr（Ⅵ）染毒濃度及有效的DZ、BAP

2、TA/AM干預(yù)濃度。其后續(xù)試驗(yàn)DZ定為50μmol/L，BAPTA/AM為20μmol/L，預(yù)處理1h，Cr（Ⅵ）作用濃度為20μmol/L，染毒時(shí)間為6h。將Hep3B細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組（第1組）、Cr（Ⅵ）染毒組（第2組）、DZ+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組（第3組）、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組（第4組）、BAPTA/AM+DZ+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預(yù)染毒組（第5組）。姬姆薩染色、電鏡觀察及彗星實(shí)驗(yàn)法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)及細(xì)胞DNA損傷

3、情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，熒光分光光度法檢測(cè)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（PTP）及跨膜電位（△ψm）、熒光比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，化學(xué)比色法檢測(cè)線粒體Ca2+-ATP酶。 結(jié)果： 1.Cr（Ⅵ）染毒及干預(yù)后染毒處理對(duì)Hep3B細(xì)胞存活率的影響：不同濃度Cr（Ⅵ）單獨(dú)處理Hep3B細(xì)胞24h，Cr（Ⅵ）染毒各組與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率存在顯著性差異（P<0.05），隨Cr（Ⅵ）濃度的增加，Hep3B細(xì)胞存活率有下降的趨勢(shì)，

4、且存在著濃度-反應(yīng)關(guān)系（P<0.01），其相關(guān)系數(shù)r=-0.948。在50μmol/L濃度的DZ和20μmol/L濃度的BAPTA/AM預(yù)處理細(xì)胞1h后，20μmol/LCr（Ⅵ）染毒Hep3B細(xì)胞的存活率與20μmol/L Cr（Ⅵ）單獨(dú)處理細(xì)胞存活率相比有明顯增高。 2.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響：光鏡下姬姆薩染色觀察發(fā)現(xiàn)，20μmol/L Cr（Ⅵ）處理6h，引起部分Hep3B細(xì)胞皺縮或腫大，染色質(zhì)濃染，細(xì)

5、胞間隙擴(kuò)大，胞質(zhì)間空泡增多，細(xì)胞膜和核膜不完整或消失，染色質(zhì)嗜堿性降低；DZ和BAPTA/AM預(yù)處理細(xì)胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h，可見大部分細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，部分細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，少部分細(xì)胞核膜不完整。電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)Cr（Ⅵ）染毒組細(xì)胞出現(xiàn)表面微絨毛減少，線粒體腫脹、嵴消失、空泡狀變，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)透亮區(qū)、呈空泡狀變等細(xì)胞凋亡或壞死的表現(xiàn)；DZ預(yù)處理對(duì)線粒體有一定的保護(hù)作用。 3.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞DNA損傷的影響

6、：Cr（Ⅵ）染毒組、DZ+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組與DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預(yù)染毒組細(xì)胞DNA損傷程度與對(duì)照組相比顯著增加（P<0.05），而加入線粒體保護(hù)劑DZ和細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA/AM預(yù)處理后，各干預(yù)染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比，DNA損傷程度明顯減輕（P<0.05）。 4.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示20μmol/L Cr（Ⅵ）染

7、毒組壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多；DZ、BAPTA/AM預(yù)處理細(xì)胞1h后Cr（Ⅵ）染毒6h，各干預(yù)處理組正常細(xì)胞比Cr（Ⅵ）染毒組明顯增多，壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，比Cr（Ⅵ）染毒組明顯減少。 5.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞線粒體膜的影響：Cr（Ⅵ）染毒組及各干預(yù)染毒組細(xì)胞與對(duì)照組相比PTP開放度明顯增加（P<0.05），線粒體膜電位明顯降低（p<0.05）；各干預(yù)染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比PTP開放度明顯降低（P<0.

8、05），線粒體膜電位明顯升高（P<0.05）。 6.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響：Cr（Ⅵ）染毒組及各干預(yù)染毒組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯增加（P<0.05）：各干預(yù)染毒組與Cr（Ⅵ）染毒組相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低（P<0.05）。 7.染毒與干預(yù)處理對(duì)Hep3B細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體膜Ca2+_ATP酶的影響：Cr（Ⅵ）染毒組、BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組細(xì)胞膜Ca2+-AT

9、P酶活力比對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；各干預(yù)染毒組細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶活力與Cr（Ⅵ）染毒組比較明顯增加（P<0.05）。Cr（Ⅵ）染毒組及各干預(yù)染毒組線粒體膜Ca2+-ATP酶活力與對(duì)照組相比均明顯降低（P<0.05）； DZ+Cr（Ⅵ）干預(yù)染毒組、DZ+BAPTA/AM+Cr（Ⅵ）聯(lián)合干預(yù)染毒組線粒體膜Ca2+-ATP酶活力與Cr（Ⅵ）染毒組比較明顯增加（P<0.05）。 結(jié)論： 20μmol/L Cr（Ⅵ）