苯妥英鈉及七十味珍珠丸對大鼠肝細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:癲癇（Epilepsy，EP）是一組由不同病因引起的，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常具有自限性的異常放電所致，以發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性及通常為刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。臨床上，仍以抗癲癇藥物(Antiepileptic drug，AED)為主要的治療手段。苯妥英鈉(Phenytoin sodium，PHT-Na)是臨床上常用的AED，也是抗癲癇大發(fā)作的首選藥物。七十味珍珠丸(Rannasangpei，RNSP)是最有

2、代表性的名貴藏成藥之一，具有安神、鎮(zhèn)靜等功效，有時也用于抗癲癇治療。近年，抗癲癇藥物造成肝損傷的報道逐漸增加，尤其是聯(lián)合用藥更增加了肝損傷的風(fēng)險。肝細胞凋亡被認為是藥物性肝損傷基本機制之一。在細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)被稱為“凋亡執(zhí)行者”;Fas蛋白在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中起著非常重要的作用。本實驗通過灌胃法給予SD大鼠苯妥英鈉及七十味珍珠丸，并運用免疫組織化學(xué)方法測定SD大鼠肝組織內(nèi)casp

3、ase-3及Fas蛋白表達水平，探討苯妥英鈉及七十味珍珠丸對大鼠肝細胞凋亡的影響以及其可能的機制，為藥物的安全性基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，進一步指導(dǎo)臨床用藥，減少藥物不良反應(yīng)，提高生活質(zhì)量。
　　 方法:
　　 1、動物及分組:10周齡清潔級健康雄性成熟SD大鼠40只，實驗起始體重200±20g。隨機分為苯妥英鈉組.(PHT組)，七十味珍珠丸組(RNSP組)，苯妥英鈉+七十味珍珠丸組(PHT+RNSP組)，正常對照組(NS組)，

4、每組10只。各組再隨機分為兩個亞組即10天亞組（PHT-10組、RNSP-10組，PHT+RNSP-10組、NS-10組）和20天亞組(PHT-20組、RNSP-20組、PHT+RNSP-20組、NS-20組)，每亞組5只，分別喂養(yǎng)10天、20天。
　　 2、實驗干預(yù):PHT組、RNSP組、PHT+RNSP組分別按成人體重平均計量的25倍用自制的灌胃器進行藥物干預(yù)，每天兩次;生理鹽水組給予等量生理鹽水，每天兩次。
　　

5、3、肝組織石蠟切片制作:各組大鼠在藥物干預(yù)結(jié)束后24小時內(nèi)經(jīng)10％的水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，打開腹腔取肝左葉組織，體積塊約1cm3，迅速放入4％多聚甲醛固定液中，24小時后經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片制作石蠟切片。
　　 4、HE染色:石蠟切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，光鏡觀察各組肝臟組織學(xué)改變。
　　 5、凋亡的檢測:免疫組織化學(xué)法檢測caspase-3及Fas在肝細胞的表達情況，并分

6、別計算光鏡下陽性表達的細胞率。
　　 6、統(tǒng)計處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行方差分析，用One-WayANOVA檢驗比較多組間均數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各組均數(shù)間用SNK檢驗兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1、HE染色
　　 1.1、除PHT-20組以外各組大鼠肝組織切片中可見肝臟基本結(jié)構(gòu)正常:肝細胞以中央靜脈為中心向四周輻射狀排列，肝索、肝竇形態(tài)正常;肝細胞呈多邊形，細胞分界清晰，細胞

7、核大而圓，呈藍色或藍紫色，部分有雙核或多倍體核，核仁1-2個，胞質(zhì)呈粉紅色，染色均勻。
　　 1.2、PHT-20組可見少量細胞空泡變性及胞質(zhì)嗜酸性增強，但未觀察到核皺縮、凋亡小體等典型凋亡特征。
　　 2、凋亡檢測結(jié)果:caspase-3在肝組織中表達陽性的細胞顯示為棕黃色或棕褐色，主要在細胞的胞漿內(nèi)表達，部分可在細胞核表達;Fas在肝組織中表達陽性的細胞顯示為棕黃色，可在細胞膜和（或）細胞漿內(nèi)表達，以中央靜脈周圍表現(xiàn)

8、明顯。
　　 2.1、各10天亞組中caspase-3、Fas表達陽性細胞率組間比較均無顯著差異。
　　 2.2、各20天亞組中caspase-3、Fas表達陽性細胞率比較:RNSP-20組與NS-20組比較無顯著差異;PHT-20組較RNSP-20組、NS-20組明顯升高(P＜0.05);PHT+RNSP-20組較RNSP-20組、NS-20組明顯升高(P＜0.05);PHT-20組較PHT+RNSP-20組明顯升高(

9、P＜0.05)。
　　 2.3、各干預(yù)組中10天與20天亞組caspase-3、Fas表達陽性細胞率比較:RNSP-20組與RNSP-10組及NS-20組與NS-10組比較無顯著差異;PHT-20組較PHT-10組明顯升高(P＜0.05);PHT+RNSP-20組較PHT+RNSP-10組明顯升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、HE染色觀察肝組織的大體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)除PHT-20組以外各組動物肝細胞形態(tài)正

10、常，結(jié)構(gòu)排列整齊，說明大鼠口服RNSP及PHT與RNSP合用后肝臟的大體結(jié)構(gòu)未受到明顯影響;PHT-20組可見少量細胞空泡變性及嗜酸性增強，說明大鼠長期口服苯妥英鈉后輕度影響肝細胞形態(tài)。
　　 2、caspase-3和Fas在肝組織中的表達情況
　　 2.1、PHT-20組表達caspase-3和Fas陽性的細胞率較NS-20組、PHT-10組均明顯升高，說明隨著服藥時間的延長，苯妥英鈉可促進肝細胞的凋亡，提示苯妥英鈉引

11、起肝臟不良反應(yīng)可能由于細胞凋亡增加，其機制可能與Fas介導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑有關(guān)。
　　 2.2、RNSP組表達caspase-3和Fas陽性的細胞率較NS組均未見明顯差異，說明七十味珍珠丸對肝細胞凋亡無明顯影響。
　　 2.3、PHT-20組表達caspase-3和Fas陽性的細胞率較PHT+RNSP-20組均明顯升高，說明七十味珍珠丸一定程度上減弱了苯妥英鈉誘導(dǎo)肝細胞凋亡的作用，提示七十味珍珠丸可能在苯妥英鈉致肝臟不