苯妥英鈉及七十味珍珠丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的:癲癇（Epilepsy，EP）是一組由不同病因引起的，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常具有自限性的異常放電所致，以發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性及通常為刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。臨床上，仍以抗癲癇藥物(Antiepileptic drug，AED)為主要的治療手段。苯妥英鈉(Phenytoin sodium，PHT-Na)是臨床上常用的AED，也是抗癲癇大發(fā)作的首選藥物。七十味珍珠丸(Rannasangpei，RNSP)是最有

2、代表性的名貴藏成藥之一，具有安神、鎮(zhèn)靜等功效，有時(shí)也用于抗癲癇治療。近年，抗癲癇藥物造成肝損傷的報(bào)道逐漸增加，尤其是聯(lián)合用藥更增加了肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)。肝細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是藥物性肝損傷基本機(jī)制之一。在細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)被稱(chēng)為“凋亡執(zhí)行者”;Fas蛋白在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃法給予SD大鼠苯妥英鈉及七十味珍珠丸，并運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定SD大鼠肝組織內(nèi)casp

3、ase-3及Fas蛋白表達(dá)水平，探討苯妥英鈉及七十味珍珠丸對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響以及其可能的機(jī)制，為藥物的安全性基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥，減少藥物不良反應(yīng)，提高生活質(zhì)量。
　　 方法:
　　 1、動(dòng)物及分組:10周齡清潔級(jí)健康雄性成熟SD大鼠40只，實(shí)驗(yàn)起始體重200±20g。隨機(jī)分為苯妥英鈉組.(PHT組)，七十味珍珠丸組(RNSP組)，苯妥英鈉+七十味珍珠丸組(PHT+RNSP組)，正常對(duì)照組(NS組)，

4、每組10只。各組再隨機(jī)分為兩個(gè)亞組即10天亞組（PHT-10組、RNSP-10組，PHT+RNSP-10組、NS-10組）和20天亞組(PHT-20組、RNSP-20組、PHT+RNSP-20組、NS-20組)，每亞組5只，分別喂養(yǎng)10天、20天。
　　 2、實(shí)驗(yàn)干預(yù):PHT組、RNSP組、PHT+RNSP組分別按成人體重平均計(jì)量的25倍用自制的灌胃器進(jìn)行藥物干預(yù)，每天兩次;生理鹽水組給予等量生理鹽水，每天兩次。
　　

5、3、肝組織石蠟切片制作:各組大鼠在藥物干預(yù)結(jié)束后24小時(shí)內(nèi)經(jīng)10％的水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，打開(kāi)腹腔取肝左葉組織，體積塊約1cm3，迅速放入4％多聚甲醛固定液中，24小時(shí)后經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片制作石蠟切片。
　　 4、HE染色:石蠟切片經(jīng)蘇木素-伊紅染色后，光鏡觀察各組肝臟組織學(xué)改變。
　　 5、凋亡的檢測(cè):免疫組織化學(xué)法檢測(cè)caspase-3及Fas在肝細(xì)胞的表達(dá)情況，并分

6、別計(jì)算光鏡下陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞率。
　　 6、統(tǒng)計(jì)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行方差分析，用One-WayANOVA檢驗(yàn)比較多組間均數(shù)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組均數(shù)間用SNK檢驗(yàn)兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1、HE染色
　　 1.1、除PHT-20組以外各組大鼠肝組織切片中可見(jiàn)肝臟基本結(jié)構(gòu)正常:肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向四周輻射狀排列，肝索、肝竇形態(tài)正常;肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞分界清晰，細(xì)胞

7、核大而圓，呈藍(lán)色或藍(lán)紫色，部分有雙核或多倍體核，核仁1-2個(gè)，胞質(zhì)呈粉紅色，染色均勻。
　　 1.2、PHT-20組可見(jiàn)少量細(xì)胞空泡變性及胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，但未觀察到核皺縮、凋亡小體等典型凋亡特征。
　　 2、凋亡檢測(cè)結(jié)果:caspase-3在肝組織中表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞顯示為棕黃色或棕褐色，主要在細(xì)胞的胞漿內(nèi)表達(dá)，部分可在細(xì)胞核表達(dá);Fas在肝組織中表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞顯示為棕黃色，可在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，以中央靜脈周?chē)憩F(xiàn)

8、明顯。
　　 2.1、各10天亞組中caspase-3、Fas表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率組間比較均無(wú)顯著差異。
　　 2.2、各20天亞組中caspase-3、Fas表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率比較:RNSP-20組與NS-20組比較無(wú)顯著差異;PHT-20組較RNSP-20組、NS-20組明顯升高(P＜0.05);PHT+RNSP-20組較RNSP-20組、NS-20組明顯升高(P＜0.05);PHT-20組較PHT+RNSP-20組明顯升高(

9、P＜0.05)。
　　 2.3、各干預(yù)組中10天與20天亞組caspase-3、Fas表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率比較:RNSP-20組與RNSP-10組及NS-20組與NS-10組比較無(wú)顯著差異;PHT-20組較PHT-10組明顯升高(P＜0.05);PHT+RNSP-20組較PHT+RNSP-10組明顯升高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、HE染色觀察肝組織的大體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)除PHT-20組以外各組動(dòng)物肝細(xì)胞形態(tài)正

10、常，結(jié)構(gòu)排列整齊，說(shuō)明大鼠口服RNSP及PHT與RNSP合用后肝臟的大體結(jié)構(gòu)未受到明顯影響;PHT-20組可見(jiàn)少量細(xì)胞空泡變性及嗜酸性增強(qiáng)，說(shuō)明大鼠長(zhǎng)期口服苯妥英鈉后輕度影響肝細(xì)胞形態(tài)。
　　 2、caspase-3和Fas在肝組織中的表達(dá)情況
　　 2.1、PHT-20組表達(dá)caspase-3和Fas陽(yáng)性的細(xì)胞率較NS-20組、PHT-10組均明顯升高，說(shuō)明隨著服藥時(shí)間的延長(zhǎng)，苯妥英鈉可促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡，提示苯妥英鈉引

11、起肝臟不良反應(yīng)可能由于細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制可能與Fas介導(dǎo)的死亡受體凋亡途徑有關(guān)。
　　 2.2、RNSP組表達(dá)caspase-3和Fas陽(yáng)性的細(xì)胞率較NS組均未見(jiàn)明顯差異，說(shuō)明七十味珍珠丸對(duì)肝細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。
　　 2.3、PHT-20組表達(dá)caspase-3和Fas陽(yáng)性的細(xì)胞率較PHT+RNSP-20組均明顯升高，說(shuō)明七十味珍珠丸一定程度上減弱了苯妥英鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的作用，提示七十味珍珠丸可能在苯妥英鈉致肝臟不