整合素avβ3受體顯像無創(chuàng)性評估大鼠肝纖維化的可行性研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是不同病因引起的肝臟慢性損傷后實(shí)質(zhì)再生，同時(shí)伴隨間質(zhì)過度增生，潛在可逆的組織修復(fù)重建過程。肝纖維化評估對于慢性肝病的診斷和干預(yù)評價(jià)尤為重要，目前還沒一種可靠的肝纖維化無創(chuàng)性評估方法。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)活化和表型改變是肝纖維化發(fā)生的中心事件，決定著肝纖維化轉(zhuǎn)歸。血管新生(angiogenesis)是組織損傷修復(fù)的必要條件。HSC活化、細(xì)胞外基質(zhì)(extr

2、ocellural matrix，ECM)增多同時(shí)伴有新生血管形成是進(jìn)展性肝纖維化修復(fù)重建中突出的病理特征。
　　 整合素(integrin)是黏附分子家族中，由一個α亞基和一個β亞基非共價(jià)結(jié)合形成的跨細(xì)胞膜受體，介導(dǎo)細(xì)胞和ECM、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附和整合細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞。生理情況下整合素為細(xì)胞非組成性表達(dá)，在整合素家族中各亞型的表達(dá)有時(shí)序性和分布特異性。整合素αvβ3亞型是最廣泛的ECM受體，主要介導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞與纖維連接蛋白、纖

3、維蛋白原、Ⅰ型膠原、玻璃黏結(jié)蛋白、層黏蛋白、Ⅷ因子相關(guān)抗原(vWF)等ECM的黏附，并和血小板衍生的生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ-1)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)等細(xì)胞因子有信號協(xié)同作用，主要傳遞和細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動、分布、定居、生存或凋亡等有關(guān)的細(xì)胞信號。正常肝組織僅門靜脈周圍表達(dá)少量整合素αvβ3，肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、靜止HSC和正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)該亞型。實(shí)驗(yàn)研究了整合素αvβ3在活化HSC和肝纖維化組織

4、中的表達(dá)，探討整合素αvβ3表達(dá)、血管新生與肝纖維化間質(zhì)重塑的關(guān)系。
　　 精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGO)三肽模體是ECM中保守序列，也是ECM和整合素受體識別常見位點(diǎn)。整合素αvβ3能識別ECM中特異構(gòu)象的RGD配體。人工合成含RGD肽鏈高通量篩選發(fā)現(xiàn)，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸(RGDyK)、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸(或RGDfK)等五肽分子也

5、能和整合素αvβ3受體特異結(jié)合，對五肽中賴氨酸上活性氨基進(jìn)行小分子修飾并不影響受體與配基結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)中通過固相合成整合素αvβ3受體的RGD環(huán)肽(cRGD)配基，設(shè)計(jì)用羧基熒光素(FAM)和锝99同位素(99mTC)等示蹤分子標(biāo)記cRGD作為探針，探討人工合成的cRGD配基對活化HSC和肝纖維化組織的靶向性結(jié)合是課題研究的主要工作。
　　 建立在肝纖維化組織間質(zhì)重建的分子病理基礎(chǔ)上，以99mTC標(biāo)記的cRGD為示蹤分子，通過單

6、光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層成像(SPECT)探測肝纖維化不同時(shí)期肝臟放射性活度的相對變化(肝臟/心臟計(jì)數(shù)比值)，并和常規(guī)B型超聲、磁共振儀(MRI)比較早期肝纖維化的影像表現(xiàn)。嘗試應(yīng)用分子影像方法，根據(jù)肝臟中整合素αvβ3受體結(jié)合cRGD配基的變化信息，來反映慢性損傷肝組織重建過程中活化細(xì)胞水平及與肝纖維化程度的關(guān)系，為建立一種敏感、特異、可靠的肝纖維化無創(chuàng)性受體顯像評估方法的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 課題研究分為以下六部分；

7、>　　 第一部分、HSC的分離、培養(yǎng)、鑒定和體外活化模型的建立
　　 目的：建立一種穩(wěn)定可靠的HSC分離方法，為體外研究提供細(xì)胞模型。
　　 方法：Hank’s液在體灌洗大鼠肝臟，離體后用Ⅳ膠原酶、鏈蛋白酶、DNaseI消化肝臟，11％Nycodenz連續(xù)梯度液分離出大鼠HSC，計(jì)數(shù)細(xì)胞得率，0.2％臺盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率。自發(fā)熒光、透射電鏡、蘇丹Ⅲ染色觀察細(xì)胞脂滴，Desmin、α-SMA免疫化學(xué)和熒光染色對HSC進(jìn)

8、行鑒定和純度分析。分離后HSC按1-4×106密度接種于未包被塑料培養(yǎng)瓶或皿，含10％胎兒牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃含5％CO295％空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過延長培養(yǎng)誘導(dǎo)HSC活化。
　　 結(jié)果：分離HSC得率3.5±0.8×107/只大鼠，細(xì)胞活率>9096，分離第1天自發(fā)熒光和第3天desmin染色陽性細(xì)胞>90％。HSC隨著體外培養(yǎng)形態(tài)明顯改變，分離培養(yǎng)7天后α-SMA陽性細(xì)胞>90％，培養(yǎng)14天或傳代后>95％陽性。

9、r>　　 結(jié)論：肝臟離體后消化能達(dá)到在體消化同樣的效果，應(yīng)用Nycodenz密度分離介質(zhì)可獲得滿意HSC得率和純度。新分離大鼠HSC培養(yǎng)7天后超過90％激活表型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨疕SC。
　　 第二部分、整合素αvβ3受體在HSC活化過程中的表達(dá)
　　 目的：探討HSC表型轉(zhuǎn)變過程中整合素αvβ3受體和α-SMA的定性、定位、定量表達(dá)。
　　 方法：HSC培養(yǎng)的第1、3、5、7和14天分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白?？俁

10、NA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，分別通過real-time PCR和Western Blot分析整合素αv、β3和α-SMA mRNA和蛋白質(zhì)在HSC活化過程中的表達(dá)。靜止期細(xì)胞和激活細(xì)胞期HSC，分別進(jìn)行α-SMA和整合素αvβ3細(xì)胞免疫熒光染色激光共聚焦觀察。
　　 結(jié)果：HSC活化過程中整合素αvβ3表達(dá)水平變化有顯著性差異(P<0.01)，第14天時(shí)在mRNA和蛋白質(zhì)水平比第1天，分別增加18倍和5.2倍。而比較7天和14天時(shí)表

11、達(dá)則無明顯差異。免疫熒光雙染色顯示活化HSC中整合素αvβ3極性表達(dá)于細(xì)胞膜，α-SMA表達(dá)于細(xì)胞漿并且和整合素αvβ3有共定位。
　　 結(jié)論：整合素αvβ3是激活狀態(tài)HSC的表型受體，表達(dá)上調(diào)與HSC活化和活化狀態(tài)維持有關(guān)。
　　 第三部分、整合素αvβ3 RGD環(huán)肽配基與HsC的結(jié)合分析
　　 目的：研究HSC對羧基熒光素(FAM)標(biāo)記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸(FAM-cRGD)環(huán)

12、五肽的結(jié)合和內(nèi)化。計(jì)算活化HSC對125I標(biāo)記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸的親和力和受體容量。
　　 方法：采用C末端保護(hù)固相法合成精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-賴氨酸環(huán)五肽，羧基熒光素合成樹脂上和環(huán)五肽中賴氨酸上的氨基固相結(jié)合為標(biāo)記的熒光分子探針(FAM-cRGD)。高效液相色譜法(HPLC)和質(zhì)譜法(MS)檢測FAM-cRGD的純度和分子量。熒光示蹤觀察HSC對FAM-cRGD探針的攝取

13、和內(nèi)化。流式細(xì)胞儀(FCM)分析HSC孵育FAM-cRGD后細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的變化和濃度、時(shí)間效應(yīng)。受體放射性配基結(jié)合分析(RBA)測定HSC對125I標(biāo)記精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸-(右旋)酪氨酸-賴氨酸的平衡解離常數(shù)(Kd)和最大結(jié)合點(diǎn)數(shù)(Bmax)。
　　 結(jié)果：熒光示蹤顯示靜止HSC不結(jié)合FAM-cRGD探針，活化HSC結(jié)合FAM-cRGD并攝入細(xì)胞漿，但無細(xì)胞核的內(nèi)化。流式細(xì)胞儀分析提示，靜止期HSC和10μmFAM-

14、cRGD37℃孵育45分鐘，平均熒光強(qiáng)度和本底比較無明顯變化。而活化HSC和10μM FAM-cRGD37℃孵育45分鐘，平均熒光強(qiáng)度較本底增高6.6倍，活化HSC和10μM FAM-cRGD、150μM cRGD37℃共同孵育45分鐘，平均熒光強(qiáng)度抑制超過30％，活化HSC平均熒光強(qiáng)度改變有隨FAM-cRGD孵育濃度和孵育時(shí)間延長而增加的趨勢。受體放射性配基結(jié)合分析，通過Scatchard作圖法求出活化HSC對cRGD結(jié)合的Kd為4.

15、808×10-9mol/L和Bmax為2.112×10-10mol/L。
　　 結(jié)論：活化HSC能與整合素αvβ3受體的cRGD發(fā)生受體-配基樣結(jié)合，活化HSC對cRGD配基有較高的親和力和受體容量。
　　 第四部分、肝纖維化中的整合素αvβ3表達(dá)與血管新生
　　 目的：建立兩種大鼠肝肝纖維化模型，探討肝纖維化組織中整合素αvβ3表達(dá)及與血管新生的關(guān)系。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射和膽總管結(jié)

16、扎(BDL)誘導(dǎo)建立兩種大鼠肝纖維化模型。建模的第3周末、9周末分別進(jìn)行肝組織天狼星紅染色和計(jì)算機(jī)圖像分析、整合素αvβ3和血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)免疫化學(xué)染色、整合素αvβ3和與α-SMA免疫熒光雙重染色及激光共聚焦觀察和real-time PCR和Western blot分析肝組織中整合素αvβ3、CD31在mRNA和蛋白表達(dá)水平表達(dá)的相對定量。
　　 結(jié)果：肝纖維化程度隨建模時(shí)間延長而加重。兩種肝纖維化大鼠和對照

17、大鼠比較，肝組織中整合素αvβ3和CD31在mRNA和蛋白表達(dá)水平有顯著性差異(TAA組F=28.66，P<0.01和F=19.62 P<0.01，BDL組F=32.60 P<0.01和F=42.36P<0.01)，隨肝纖維化進(jìn)展而有升高的趨勢。免疫組織化學(xué)和免疫熒光化學(xué)染色提示，在肝纖維化擴(kuò)大的匯管區(qū)及纖維隔中有新生血管形成，在間質(zhì)中整合素αvβ3與α-SMA表達(dá)部位一致，從匯管區(qū)向肝實(shí)質(zhì)深入。
　　 結(jié)論：肝纖維化進(jìn)展中整合

18、素αvβ3表達(dá)水平增加與HSC活化和血管新生有關(guān)，并與間質(zhì)重建程度平行。
　　 第五部分、肝組織整合素αvβ3放射自顯影和125I-cRGD在體內(nèi)的分布
　　 目的：分析肝纖維化組織對125I-cRGD配基的結(jié)合，和125I-cRGD在早期肝纖維大鼠中的分布。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，在第3周末、9周末分別進(jìn)行肝組織冰凍切片，切片分別和125I-cRGD、125I-cRGD加50

19、0倍化學(xué)劑量cRGD(特異阻斷)進(jìn)行4℃孵育2小時(shí)，沖洗切片后接觸法暴光2周，進(jìn)行受體組織放射自顯影。6只正常大鼠和6只TAA3周肝纖維化大鼠，各3只分別進(jìn)行尾靜脈注射6μCi125I-cRGD，各3只注射500倍化學(xué)劑量cRGD特異阻斷后再注射6μCi125I-cRGD、在注射后45min分別取材肝、脾、腦、腎、心、肺和肌肉，測定各臟器的放射性活度，計(jì)算各臟器放射性比活度(％ID/g)。
　　 結(jié)果：正常大鼠、TAA3周、TA

20、A9周大鼠切片暴光后的相對灰度分別為8.1±1.6、18.7±2.6和28.7±3.4，用cRGD阻斷的切片相對灰度分別為7.7±1.7、12.1±2.5和19.3±3.3，三組間比較差異有顯著性(P<0.01)。在TAA3周和TAA9周中，未用cRGD阻斷和cRGD阻斷比較差異有顯著性P=0.02和P=0.041，阻斷的切片中相對灰度降低。正常大鼠和TAA3周的早期肝纖維化大鼠中，125I-cRGD體內(nèi)分布以腎臟組織中最高，其次是肝臟

21、，腦組織最低。正常大鼠中肝臟125I-cRGD的分布％ID/g，在未阻斷和阻斷大鼠分別為0.11±0.03、0.10±0.04，在TAA3周大鼠分別為0.17±0.02和0.12±0.03，4組比較F=5.175，P=0.049差異有顯著性，TAA3周大鼠肝臟中的％ID/g較高，在用cRGD阻斷時(shí)肝臟中放射性比活度有下降的趨勢。而比較各組間腎、脾、心、肺、腦、肌肉等臟器放射性比活度則差異無顯著性。
　　 結(jié)論：體內(nèi)外的研究提示肝

22、纖維化組織對125I-cRGD配基有較高的結(jié)合和攝取，并能被未標(biāo)記的cRGD所競爭。
　　 第六部分、肝臟整合素αvβ3受體顯像評估肝纖維化
　　 目的：以99mTc-DTPA-cRGD為示蹤劑應(yīng)用SPECT對肝纖維化大鼠肝臟中整合素αvβ3受體進(jìn)行分子顯像，測定正常和肝纖維化大鼠間肝/心的放射性計(jì)數(shù)的比值。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。合成樹脂上二亞乙基三基三胺五乙酸(DTPA)固相結(jié)

23、合cRGD(DTPA-cRGD)，高锝酸鹽(99mTc04-)氯化亞錫還原法標(biāo)記DTPA-cRGD(99mTc-DTPA-cRGD)，紙層析法測定放射化學(xué)純度。TAA3周早期肝纖維化大鼠進(jìn)行肝臟B型超聲和MRI掃描觀察影像表現(xiàn)。在TAA3周和TAA9周，尾靜脈注射99mTc-DTPA-cRGD6mCi/只，用小動物SPECT進(jìn)行大鼠腹部掃描，計(jì)算注藥后45min，感興趣區(qū)(ROI)的肝/心放射性計(jì)數(shù)比。
　　 結(jié)果：測定99mT

24、c-DTPA-cRGD的放射化學(xué)純度>95％，室溫下4小時(shí)保持穩(wěn)定。注射99mTc-DTPA-cRGD后45min，正常組、TAA3周和TAA9周組中感興趣區(qū)的肝/心放射性計(jì)數(shù)分別為1.73±0.35、2.7±0.44、3.73±0.65差異有顯著性(F=13.1，P=0.006)。比較正常大鼠和TAA3周大鼠，TAA3周和TAA9周大鼠組間感興趣區(qū)的肝/心放射性活度比值差異有顯著性(P<0.05)。常規(guī)MRI和B型超聲檢測TAA3周的