人HSP70D的表達(dá)純化及其免疫佐劑樣效應(yīng)研究.pdf

1、在該研究中,我們采用原核表達(dá)系統(tǒng),對(duì)人HSP70D分子進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)純化,旨在建立一種新的HSP70純化的方式,研究所純化的人HSP70D的佐劑樣效應(yīng),并將其應(yīng)用于腫瘤的免疫治療.為了獲得足夠數(shù)量及符合臨床試驗(yàn)要求的重組人HSP70,我們?cè)谇耙徊糠謱?shí)驗(yàn)完成了基因工程人HSP70D的高表達(dá)菌種的構(gòu)建及篩選的基礎(chǔ)上,對(duì)其發(fā)酵表達(dá)條件及純化條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的條件和方法,建立穩(wěn)定、可靠的生產(chǎn)工藝.首先通過搖床發(fā)酵實(shí)驗(yàn)我們觀察了不同的培養(yǎng)

2、基包括LB、2YT、SOB、SOC、M9CA培養(yǎng)基對(duì)工程菌生長及重組HSP70D蛋白表達(dá)量的影響.該工程菌采用的載體pET24a以T7作為啟動(dòng)子,它受LacI表達(dá)的阻蛋白的抑制.由于LacI的存在限制了外源基因的持續(xù)、高水平的表達(dá),對(duì)宿主菌起到穩(wěn)定作用.但誘導(dǎo)劑IPTG可以消除LacI表達(dá)阻遏蛋白對(duì)外源基因表達(dá)抑制.不同濃度IPTG加入后,對(duì)目的蛋白的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定的影響.通過小量發(fā)酵實(shí)驗(yàn),我們探討了不同IPTG濃度對(duì)rhHSP70表達(dá)

3、量的影響,并觀察了不同誘導(dǎo)時(shí)間后rhHSP70D的表達(dá)量.綜上所述,該研究克隆了人HSP70D的全長cDNA并構(gòu)建了人HSP70D的原核表達(dá)載體,篩選出高表達(dá)rhHSP70D的工程菌,建立了rhHSP70D的表達(dá)純化的中試工藝,對(duì)獲得的rhHSP70D的體外生物學(xué)活性及佐劑樣效應(yīng)進(jìn)行了研究,證實(shí)了我們表達(dá)純化的rHSP70D具備經(jīng)典HSP70的特征和功能,即能與抗原肽結(jié)合和佐劑樣效應(yīng),質(zhì)控指標(biāo)均達(dá)到中國生物制品規(guī)程的有關(guān)要求,有望作為一