人HSP22基因在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中的表達及作用研究.pdf

1、1980年Craig和McCarthy首次在黑腹果蠅基因組中分離了HSP22基因，2000年Smith等人從HELA細胞和黑色素瘤細胞基因文庫中發(fā)現(xiàn)了人HSP22基因。它由196個氨基酸組成，分子量為22kD，具有小分子熱休克蛋白(sHSP)家族保守的中央“晶體蛋白結(jié)構(gòu)域(α-crystallin)”。HSP22的mRNA在肌肉、胎盤、心臟和腦組織中高度表達，目前研究顯示HSP22具有分子伴侶，自身激酶等生物活性，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋

2、亡，其異常表達或突變與心肌肥大、阿爾茨海默癥及遠側(cè)遺傳性運動神經(jīng)病等疾病密切相關。隨著研究的不斷深入，HSP22與腫瘤的關系越來越受到人們的關注，近幾年來發(fā)現(xiàn)HSP22高表達于雌激素受體陽性的乳腺癌細胞并能被17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)誘導上調(diào)進而促進乳腺癌的發(fā)展；然而HSP22在有些腫瘤組織或細胞系中低表達，例如黑色素瘤、前列腺癌及肉瘤，而且通過去甲基化試劑5-aza-2′-deoxycytidine(地西他濱，

3、Aza-C，達珂TM)處理，或轉(zhuǎn)導HSP22能誘導人黑色素瘤細胞系SK-MEL-2和人前列腺癌細胞系PC-3凋亡?？梢奌SP22在腫瘤中的作用是多樣的。
　　 為了研究HSP22在血液系統(tǒng)腫瘤中的表達和功能，我們首先采用RT-PCR方法檢測HSP22在造血系統(tǒng)惡性腫瘤細胞系中的表達情況。在被檢測的代表不同來源的13個造血系統(tǒng)惡性腫瘤細胞系、20例不同類型的白血病患者骨髓單個核細胞及10例健康志愿者骨髓單個核細胞中均未發(fā)現(xiàn)HSP2

4、2的表達。由于熱休克蛋白家族是應激蛋白，當細胞受到高溫、物理或化學刺激的時候其表達會顯著上升。于是我們進一步用熱休克、E2、阿糖胞苷（cytarabine，Ara-c）、柔紅霉素(Daunorubicin，DRN)及Aza-C等處理白血病細胞系及白血病患者骨髓單個核細胞，發(fā)現(xiàn)只有地西他濱能誘導HSP22表達，且呈劑量依賴。于是我們推測在HSP22基因的啟動子區(qū)存在甲基化。為了證實此推測，我們用甲基化特異的PCR方法檢測了5個白血病細胞系

5、及5例健康供者和15例不同類型的白血病患者骨髓單個核細胞中HSP22基因的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)檢測的所有樣本呈現(xiàn)完全甲基化狀態(tài)，而且，地西他濱處理過的白血病細胞系甲基化狀態(tài)被部分逆轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)部分去甲基化狀態(tài)。
　　 地西他濱是一種去甲基化藥物，具有強烈的誘導細胞分化能力，目前臨床用于治療骨髓增生異常綜合征(MDS)、慢性粒細胞白血病(CML)和急性髓細胞白血病(AML)，并且旨在將其應用于更多腫瘤治療中的臨床實驗正在不斷開展。

6、甲磺酸伊馬替尼(伊馬替尼，imatinibmesylate，gleevec)是BCR/ABL+白血病最有效的治療藥物，近年來有文獻證明地西他濱與伊馬替尼對BCR/ABL+的細胞具有協(xié)同的抗白血病功能，增強白血病細胞對伊馬替尼的敏感性。我們的研究結(jié)果提示，接受地西他濱治療會使患者白血病細胞表達HSP22，而且多數(shù)熱休克蛋白家族成員都與藥物的敏感性相關，那么HSP22的表達會對白血病細胞產(chǎn)生什么作用，是否參與介導了地西他濱增強白血病細胞對伊

7、馬替尼的敏感性呢？為了進一步探究HSP22對白血病細胞的影響，我們構(gòu)建了HSP22慢病毒表達載體，感染K562和Namalwa細胞，熒光顯微鏡及流式細胞儀觀察并測試瞬時感染效率，RT-PCR和WestemBlot方法鑒定HSP22的表達。并通過生長曲線、細胞周期、集落形成實驗來評價腫瘤細胞增殖、生長特性、集落形成能力，AnnexinV/7-AAD方法檢測腫瘤細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)導空載體的對照細胞相比，HSP22能抑制K562細胞

8、體內(nèi)增殖和Namalwa細胞體外增殖，并抑制二者集落形成，但對于二者的細胞周期和凋亡沒有明顯影響。為了進一步探究HSP22是否可使白血病細胞對伊馬替尼的的敏感性增強，是否參與介導了地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同作用，我們用伊馬替尼處理轉(zhuǎn)導HSP22和空載體的K562(BCR/ABL+)細胞，并用AnnexinV/7-AAD方法檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)HSP22能增強伊馬替尼誘導的K562細胞凋亡，此現(xiàn)象具有劑量和時間依賴性。為了進一步明確HSP

9、22增加腫瘤細胞對伊馬替尼敏感性的機制，我們采用real-timePCR方法檢測了轉(zhuǎn)導HSP22和空載體的K562細胞mdrl和BCR/ABL基因的表達，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)導HSP22使K562細胞中這兩種基因的表達水平顯著降低，提示HSP22增加腫瘤細胞對伊馬替尼敏感性的作用可能是通過降低P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)轉(zhuǎn)運體的功能從而減少伊馬替尼的泵出以及減少BCR/ABL融合蛋白的表達從而降低其酪氨酸激酶的活性來實現(xiàn)的

10、。由于地西他濱能夠誘導多種基因表達，為了進一步確定HSP22是否在介導地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同抗白血病功能中起到特異的作用，我們在地西他濱誘導野生型K562細胞表達HSP22的基礎上使用HSP22基因特異的siRNA干擾其表達，再使用伊馬替尼處理，發(fā)現(xiàn)干擾HSP22的表達能降低伊馬替尼誘導的K562細胞凋亡。提示HSP22可能在介導地西他濱與伊馬替尼的協(xié)同作用中發(fā)揮特異的作用。
　　 綜上所述，我們的工作首次證明，在血液系統(tǒng)中，

11、啟動子區(qū)甲基化是HSP22不表達的原因，去甲基化試劑地西他濱能夠誘導HSP22的表達。異位表達HSP22能抑制白血病細胞的增殖和集落形成，并能增強BCR/ABL+的K562細胞系對伊馬替尼的敏感性。而且此功能可能是通過降低P-糖蛋白(P-glycoprotein)轉(zhuǎn)運體的功能和減少BCR/ABL融合蛋白的表達來實現(xiàn)的。RNA干擾實驗顯示降低HSP22的表達能減少伊馬替尼誘導的K562細胞凋亡，提示HSP22可能在介導地西他濱與伊馬替尼的