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1、1、Twist基因是1987年Thisse B等首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因。在脊椎動(dòng)物中。Twist蛋白是屬于堿性的螺旋—環(huán)—螺旋蛋白家族中的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外Twist被認(rèn)為是癌基因,影響腫瘤細(xì)胞凋亡,而且作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial. Mesenchymal transition,EMT)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,Twist對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。到目前為止,其促腫瘤作用報(bào)道多局限
2、于實(shí)體瘤,與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的關(guān)系尚不明確。 我們首先采用Real-Time PCR方法檢測(cè)了Twistl mRNA在造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況。在被檢測(cè)的代表不同來源的11個(gè)造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞系中,K562和KG1a強(qiáng)表達(dá)Twist1,U937,Namalwa,以及HL60均為弱表達(dá),CEM,NB4,Jurkat,Romas,HEL,J6—1均不表達(dá);同時(shí),我們還檢測(cè)了115例白血病患者(106例初治患者,9例治療后
3、CR患者),13例ITP患者,6例MDS患者及3例正常人骨髓,3例正常人外周血中Twist1基因的表達(dá)情況。AML患者同ITP及正常人相比,Twistl表達(dá)明顯升高(p<0.05);CML患者同ITP及正常人相比,Twist1表達(dá)明顯升高(p<0.05);ALL患者同ITP患者相比,Twist1表達(dá)量沒有明顯變化(p>0.05)。 無論相對(duì)于正常人還是其他白血病類型,CML、AML—M2,AML—M5患者均顯示出了明顯的Twis
4、t1高表達(dá)趨勢(shì)。Twist1在小于60歲的患者中高表達(dá),而在60歲以上患者中表達(dá)量低。在我們檢測(cè)的伴有t(8;21)的8例M2患者中,Twist中位表達(dá)水平0.121(0.021-0.592)反而較正常人表達(dá)水平有所降低0.2079(0.018—1.723)(p>0.05),并顯著低于AML—ETO陰性的M2患者0.596(0.03—23.804),(p<0.05)。而在CML患者中,BCR/ABL陰性的患者表達(dá)水平0.298(0.03
5、9—20.757)低于BCR/ABL陽性患者表達(dá)水平中位數(shù)0.608(0.011—56.73),但是差異不顯著(p>0.05)。70例AML患者中,62例AML進(jìn)展期患者表達(dá)中位數(shù)明顯高于8例治療后CR患者表達(dá)中位數(shù),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.00154)。在M3患者中,13例初治患者Twist1 mRNA表達(dá)中位數(shù)明顯高于治療后CR患者表達(dá)中位數(shù),但沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。AML治療后CR患者與ITP及正常人表達(dá)量比較
6、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 CML、M2和M5型白血病中Twist基因表達(dá)的升高使得Twist成為白血病診斷指標(biāo)成為可能,更加深入研究Twist在白血病發(fā)生中的作用將使我們更深刻的了解白血病發(fā)生的機(jī)制。 2、我們同時(shí)選取了代表不同來源的2個(gè)細(xì)胞系:K562和KG1a,觀察Twist1對(duì)造血系統(tǒng)惡性腫瘤的作用。設(shè)計(jì)并合成Twist1基因干擾片段shRNATwist1后,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法及電轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建的重組真核干擾載
7、體分別轉(zhuǎn)染K562和KG1a,Real-TimePCR和Western Blot方法鑒定干擾效果。選取干擾片段表達(dá)陽性細(xì)胞株,通過生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期、集落形成實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)特性、集落形成能力,AnnexinV/7—AAD方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照、陰性片段對(duì)照和未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞相比,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Twist1干擾載體的k562細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞增殖能力以及集落形成能力明顯下降(p<0.05);在
8、電轉(zhuǎn)染的另一個(gè)細(xì)胞系KG1a中,觀察到同樣的現(xiàn)象。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Twist1干擾載體的K562細(xì)胞凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染空載體及陰性片段的對(duì)照組(p<0.05)。 在實(shí)體瘤中,Twist1有一個(gè)很重要的作用即促進(jìn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT),我們研究了在K562細(xì)胞中Twist1的促遷移作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)染了Twist1干擾載體的K562細(xì)胞遷移能力明顯低于空載體和陰性對(duì)照組(p<0.05)。裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染了Twist1干擾載體的
9、K562細(xì)胞腫瘤生長(zhǎng)速度明顯低于轉(zhuǎn)染空載體和陰性片段對(duì)照載體的K562細(xì)胞組。(P<0.01)。處死裸鼠后剝離的腫瘤稱重,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Twist1干擾載體的K562細(xì)胞所形成的腫瘤重量明顯小于于轉(zhuǎn)染空載體及陰性片段對(duì)照載體的K562細(xì)胞組(P<0.01及P<0.01)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示通過shRNA干擾掉Twist1的白血病細(xì)胞K562在裸鼠體內(nèi)成瘤性降低。 我們的工作首次證明,與實(shí)體瘤相似,干擾Twist1mRNA的表達(dá)亦可
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