趨化因子受體4基因沉默對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌Mc3細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、人涎腺粘液表皮樣癌（MucoepidermoidCaecinoma，MEC）是涎腺最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的30％，盡管有時(shí)表現(xiàn)像良性病變，生長(zhǎng)比較慢，但是該腫瘤有時(shí)是高度惡性而且預(yù)后很差。低分化的涎腺粘液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，5年的存活率不超過(guò)43％。
　　趨化因子屬于小分子趨化性細(xì)胞因子超家族成員，可通過(guò)與G蛋白耦聯(lián)的受體相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重建、對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和定向性遷移。趨化因子受體4（Chemokine

2、receptor4,CXCR4）是一種7次跨膜趨化因子受體，其重要配體是（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，Stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1）。CXCR4和SDF-1形成CXCR4/SDF-1生物反應(yīng)軸，在乳腺癌、前列腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、喉癌、非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌等多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　RNA干擾（RNAinterference,RNAi）作用機(jī)制在于應(yīng)用小的雙鏈RNA引發(fā)序列特異性的基

3、因表達(dá)的“沉默”或“敲除”。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中這種雙鏈RNA可以是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（SmallhairpinRNA，shRNA）；也可以是3'-端帶有游離堿基的簡(jiǎn)單的二聚體（SmallinterferenceRNA,siRNA）。轉(zhuǎn)染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往時(shí)間比較短，而且局限于容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。與siRNA相比，應(yīng)用shRNA獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因干擾更為有效。最近，已有研究報(bào)道應(yīng)用siRNA沉默乳腺癌中CXCR4。

4、>　　至今為止，尚未見(jiàn)CXCR4/SDF-1生物反應(yīng)軸對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌增殖和轉(zhuǎn)移有調(diào)控作用的相關(guān)報(bào)道。我們推測(cè)CXCR4也可能涎腺粘液表皮樣癌增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中我們選擇了同一來(lái)源的兩種不同增殖和轉(zhuǎn)移能力的涎腺粘液表皮樣癌細(xì)胞系，MEC-1細(xì)胞系和其高轉(zhuǎn)移分離株Mc3細(xì)胞系，檢測(cè)了兩種細(xì)胞系CXCR4的差異表達(dá)以及SDF-1α的表達(dá)情況，成功構(gòu)建CXCR4-shRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Mc3細(xì)胞，阻斷其CXCR4的表達(dá)。并通過(guò)

5、一系列體外、體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)Mc3細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性，探討CXCR4對(duì)人涎腺粘液表皮樣癌可能存在的生物學(xué)效應(yīng)。主要研究方法和結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　1.CXCR4在人涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)
　　人類基因組分類芯片（BioStarH-I）篩選MEC-1細(xì)胞及Mc3細(xì)胞差異表達(dá)基因，選定靶基因CXCR4，用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)CXCR4在MEC-1細(xì)胞和Mc3細(xì)胞中的差異表達(dá)。結(jié)

6、果顯示CXCR4在Mc3細(xì)胞中高表達(dá)，而在兩種細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)SDF-1α的表達(dá)，二者無(wú)顯著性差異。
　　2.CXCR4-shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)針對(duì)CXCR4基因的shRNA，構(gòu)建pWH1-CXCR4真核表達(dá)載體，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Mc3細(xì)胞，600μg/mlG418篩選3周，300μg/mlG418繼續(xù)篩選1周。用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)穩(wěn)

7、定轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA后CXCR4mRNA和蛋白的表達(dá)水平被顯著抑制。
　　3.CXCR4-shRNA抑制Mc3細(xì)胞增殖相關(guān)特性
　　細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、裸鼠頜下腺原位移植瘤等方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)受到抑制。實(shí)驗(yàn)組、空載體組、對(duì)照組細(xì)胞群體倍增時(shí)間分別為26.5hr，20.6hr和20.4hr。CXCR4-shRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Mc3細(xì)胞軟瓊脂克隆形

8、成抑制率為33.9％；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞S期和G2期細(xì)胞比例下降；裸鼠頜下腺原位移植瘤抑制率為17.1％。
　　4.CXCR4-shRNA抑制Mc3細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)特性
　　轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞在Matrigel人工重構(gòu)基底膜上30min的粘附抑制率21.4％；趨化率和侵襲率分別降低至對(duì)照組的43.8％和52.7％；裸鼠肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率為47.6％。
　　5.C

9、XCR4-shRNA對(duì)Mc3細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響
　　免疫組化結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CXCR4-shRNA的Mc3細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.CXCR4在人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系Mc3中高表達(dá)。
　　2.CXCR4基因沉默可導(dǎo)致Mc3細(xì)胞增殖能力、體外遷移和侵襲能力降低，并能有效抑制Mc3細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，提示CXCR4與Mc3細(xì)胞的增殖及高轉(zhuǎn)移性有關(guān)。
　　3.CXCR4可以調(diào)控M