自體乙酰化誘餌蛋白酵母雙雜合篩選體系的建立.pdf

1、到目前為止,所有與修飾后細(xì)蛋白結(jié)合的蛋白鑒定僅限于生物化學(xué)方法,而在基因組范圍內(nèi)的篩選工作還很少,有報(bào)道在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源性的蛋白激酶,用雙雜合試驗(yàn)進(jìn)行翻譯后修飾特異性結(jié)合蛋白的篩選.如:在酵母中表達(dá)酪氨酸激酶或在大腸桿菌中表達(dá)哺乳動(dòng)物絲氨酸/蘇氨酸激酶,以使底物磷酸化后再用雙雜合試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行篩選.由于磷酸化過(guò)程依賴(lài)于傳統(tǒng)的酶-底物反應(yīng)(反式作用),如果外源性的酶難以從宿主細(xì)胞中眾多的蛋白中識(shí)別特異蛋白底物則接下來(lái)的篩選可能失敗.因此,為提

2、高底物磷酸化的效率,增加"誘餌"蛋白的特異性就必須過(guò)量表達(dá)激酶,而這樣可使宿主細(xì)胞中蛋白被不當(dāng)修飾導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯.為使細(xì)胞內(nèi)酵母雙雜合試驗(yàn)"誘餌"蛋白能特異地、持續(xù)修飾,我們將Gcn5 HAT結(jié)構(gòu)域和組蛋白H3尾相連,這樣酶與底物的物理性連接可能使"自體催化"現(xiàn)象發(fā)生在一個(gè)蛋白分子內(nèi)而產(chǎn)生高效率的乙?；揎?我們將組蛋白H3尾(1-59位氨基酸)與Gcn5(18-252位氨基酸)野生型相連,再連接Ga14DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和HA;用無(wú)H

3、AT活性的Gcn5變異體作為對(duì)照.將含有上述融合蛋白ORF的質(zhì)粒和載體對(duì)照分別轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中(PJ69-4 α),用抗HA和抗組蛋白H3K9/K14乙酰化抗體檢測(cè)酵母全細(xì)胞提取液中人工融合蛋白的工作情況.我們還構(gòu)建了GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA和GAL4DBD-H4-Gcn5 F221A-HA重組體,試驗(yàn)表明:GAL4DBD-H4-Gcn5 wt-HA融合蛋白有自體乙?；F(xiàn)象(H4K8)而GAL4DBD-H4-Gc n5F

4、221 A-HA則無(wú).為檢測(cè)融合蛋白能否用于酵母雙雜合篩選試驗(yàn),我們與華盛頓大學(xué)的Stanley Fields博士合作進(jìn)行高通量酵母雙雜合篩選試驗(yàn).為探索Rmtl在體外甲基化活性與組蛋白乙?；年P(guān)系,我們提出了以下假設(shè):Rmt1甲基化那些已預(yù)先乙?；腍4或H3(位置尚待確定)之精氨酸,而那些乙?；恢每梢越Y(jié)合Rmt1.但因?yàn)镽mt1的靶組蛋白可能占有很少的百分比,或僅僅在特殊情況下才存在(即在某些基因開(kāi)放時(shí)),因此RMT1缺陷不會(huì)造成