血小板整合素β3胞漿段序列調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制.pdf

1、整合素αⅡbβ3通過(guò)連接配體和介導(dǎo)雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在血小板活化過(guò)程中起重要作用。整合素αⅡbβ3通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)血小板活化，其分子機(jī)制至今尚未完全明確。在CHO細(xì)胞模型中對(duì)截短型變異體的研究表明，整合素β3羧基端RGT序列對(duì)外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要，但對(duì)內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并不具重要作用。為在自然狀態(tài)下的人類(lèi)血小板中驗(yàn)證這一機(jī)制，我們合成與整合素β3胞漿段末端RGT序列對(duì)應(yīng)的具有透膜作用的肽，使之與血小板整合素β3亞基競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相應(yīng)的信號(hào)分子。

2、十四烷?；腞GT肽(Myr-RGT)可劑量依賴(lài)性地抑制正常人類(lèi)血小板在固相纖維蛋白原上的粘附和伸展；將Myr-RGT肽與血小板共同孵育會(huì)導(dǎo)致纖維蛋白凝塊回縮功能降低。此外，RGT肽在血小板內(nèi)的存在可抑制由ADP、瑞斯托霉素或凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，但基本不影響其一相聚集。經(jīng)凝血酶活化后，Myr-RGT肽處理的血小板膜表面CD62P表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。這些結(jié)果表明，經(jīng)RGT肽處理后血小板整合素的配體結(jié)合后功能即外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制

3、。另一方面，Myr-RGT肽不影響與內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的血小板功能，如血小板的一相聚集、ADP活化的血小板與游離纖維蛋白原的結(jié)合，表明Myr-RGT肽處理的血小板的內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并未被阻斷。因此，我們首次在血小板中證實(shí)，模擬整合素β3胞漿段末端三個(gè)氨基酸序列的合成肽可選擇性調(diào)節(jié)外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基本不影響內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為進(jìn)一步明確RGT肽在血小板活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中所起作用的分子機(jī)制，我們檢測(cè)了RGT肽對(duì)整合素β3胞漿段酪氨酸磷酸化的影

4、響。我們發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)劑活化的血小板中，Myr-RGT肽對(duì)整合素胞漿段的兩個(gè)酪氨酸(Y747和Y759)的磷酸化有顯著抑制作用。這一現(xiàn)象可能與我們同時(shí)在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的RGT肽阻止整合素β3和Src激酶的相互作用有關(guān)。我們?cè)贓LISA實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到的Src-SH3與RGT肽的直接結(jié)合可證明RGT肽與整合素β3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Src，這也解釋了所觀(guān)察到的RGT肽對(duì)整合素β3和Src激酶的相互作用的抑制。相反，RGT肽不干擾talin與整合素β

5、3亞基的結(jié)合。這些結(jié)果均支持一個(gè)結(jié)論，即在完整的人類(lèi)血小板中，RGT肽通過(guò)干擾Src激酶與整合素β3的組成性結(jié)合而選擇性地阻斷外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并導(dǎo)致整合素β3胞漿段酪氨酸磷酸化水平降低。所以，在血小板中整合素β3胞漿段RGT序列與Src激酶的相互作用是外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要和充分條件，而Src和整合素β3的解離對(duì)talin和整合素β3胞漿段的結(jié)合基本無(wú)影響。在血小板研究中RGT肽及其衍生物的應(yīng)用，可使我們能選擇性調(diào)節(jié)外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而不影

6、響內(nèi)向外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并有助于我們了解RGT肽的作用機(jī)制，尋找調(diào)節(jié)血栓形成的新的靶點(diǎn)。 此外，先前的研究結(jié)果證實(shí)，整合素β3羧基末端T755NITYRGT762或R760GT762序列的缺失可影響相應(yīng)細(xì)胞通過(guò)整合素αⅡbβ3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，但無(wú)法排除截短型β3變異體本身因構(gòu)型改變而無(wú)法充分活化的可能。為此我們建立共表達(dá)整合素αⅡbβ3、與無(wú)胞漿片段IL-2R(Tac)連接的全長(zhǎng)或突變型(Y759、F754截短或N756ITY759缺

7、失)整合素β3胞漿段嵌合蛋白的細(xì)胞系，并在表達(dá)整合素αⅡbβ3、糖蛋白GPIb-Ⅸ的CHO細(xì)胞株(123細(xì)胞株)中觀(guān)察由整合素β3胞漿段突變體組成的嵌合蛋白(Tac/β3)的顯性陰性作用。全長(zhǎng)型整合素β3胞漿段嵌合蛋白的表達(dá)影響123細(xì)胞整合素αⅡbβ3的外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其細(xì)胞伸展、穩(wěn)定粘附、纖維蛋白凝塊回縮功能受到抑制。與此相比，Y759或F754截短型以及N756ITY759缺失型整合素β3胞漿段嵌合蛋白的表達(dá)均不影響整合素αⅡbβ

8、3的親和性調(diào)節(jié)即外向內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)全長(zhǎng)、截短型或缺失型的整合素β3胞漿段的顯性陰性表達(dá)完全抑制了ristocetin-vWF誘導(dǎo)的游離纖維蛋白原的結(jié)合，即由內(nèi)向外信號(hào)調(diào)控的整合素αⅡbβ3的活化。結(jié)果證實(shí)，在CHO細(xì)胞中整合素β3胞漿段末端序列T755NITYRGT762或R760GT762序列對(duì)整合素αⅡbβ3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)分別通過(guò)其與胞漿中相應(yīng)信號(hào)分子的相互作用而非由截?cái)嘧儺愺w導(dǎo)致構(gòu)型改變所致。因此，通過(guò)在CHO細(xì)胞中重建整合素活