塵螨哮喘小鼠T-bet-GATA-3-Foxp3變化及CpGODN的干預(yù)作用.pdf

1、目的：(1)建立塵螨哮喘小鼠模型并觀察模型T-bet、GATA-3、Foxp3蛋白的表達(dá)情況.(2)探討T-bet、GATA-3、Foxp3與Th1/Th2平衡、氣道炎癥形成的關(guān)系.(3)研究CpGODN對氣道炎癥、Th1/Th2平衡的調(diào)控作用及其對T-bet、GATA-3、Foxp3蛋白表達(dá)的影響.(4)觀察吸入糖皮質(zhì)激素對哮喘氣道炎癥、Th1/Th2平衡的影響. 方法：30只雌性C57BL/6J小鼠(6-8周齡)按體重大小隨

2、機(jī)分為5組:正常對照組(A組),哮喘模型組(B組),GpCODN對照組(C組),CpGODN治療組(D組),布地奈德組(E組),每組6只.正常組用生理鹽水0.2ml,其他實(shí)驗(yàn)組用塵螨抗原/氫氧化鋁(20 μg/5mg)0.2ml于d1、d10腹腔注射致敏,CpGODN治療組每次致敏時,CpGODN 20 μg與塵螨抗原混合腹腔注射,GpCODN治療對照組每次致敏時,GpCODN20 μg與塵螨抗原混合腹腔注射.d17開始激發(fā),隔日一次,

3、共7次,正常組用生理鹽水50 u l滴鼻激發(fā),其余組用塵螨抗原/生理鹽水(20 u g/50u l)滴鼻激發(fā),布地奈德組每次激發(fā)前1小時霧化布地奈德混懸液30min.末次激發(fā)后24小時處死小鼠,觀察支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(EOS﹪)的變化,用酶聯(lián)免疫吸附測(ELISA)法檢測BALF中IL-4、IL-5、IL-γ、IL-10、TGF-β 1的含量變化;取肺組織作病理檢測在光鏡、電鏡下觀察小鼠氣道炎癥情

4、況;免疫組化染色觀察CpGODN對塵螨過敏性哮喘小鼠模型肺部T-bet/GATA-3表達(dá)的影響;用免疫印跡(western-blot)法檢測肺組織中T-bet、GATA-3、Foxp3蛋白的表達(dá)水平的變化. 結(jié)果：(1)BALF中的炎癥細(xì)胞:各組BALF細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對值計(jì)數(shù)、EOS占細(xì)胞總數(shù)的百分比(EOS﹪)的比較,B組顯著高于A組(均為P<0.01);D組、E組顯著低于B組(均為P<0.01),C組顯著高于D組(均為P

5、<0.01). (2)肺組織病理改變:B組小鼠肺細(xì)織切片HE染色可見支氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤,以EOS、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞為主,支氣管上皮多處斷裂,并有基底膜增厚和平滑肌肥大增生等表現(xiàn).AB-PAS染色氣道腔內(nèi)可見大量黏液栓,杯狀細(xì)胞增生,甲苯胺藍(lán)法染色可見大量的肥大細(xì)胞及其顆粒.D組和E組的上述改變程度不一,明顯比B組的改變輕.C組比D組的改變明顯.A組則無上述表現(xiàn). (3)肺組織超微結(jié)構(gòu):電鏡下 A組(正常對照

6、組)顯示正常的肺泡隔和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,支氣管纖毛上皮細(xì)胞纖毛排列整齊;B組肺泡隔明顯增厚,炎癥細(xì)胞增多,基底膜增厚,肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞腫脹,部分脫落在肺泡中,出現(xiàn)板層小體及線粒體空泡變性現(xiàn)象,支氣管上皮細(xì)胞纖毛排列稀疏或斷裂.C組表現(xiàn)與B組接近.D組和E組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞板層小體及線粒體空泡變性現(xiàn)象不明顯,支氣管上皮細(xì)胞纖毛排列尚整齊. (4)BALF中細(xì)胞兇子:B組BALF中IL-4、IL-5的濃度均顯著高于A組(P<0.01

7、),D組、E組與B組比較顯著降低(13<0.05或P<0.01),同時D組顯著低于C組(P<0.01):B組BALF中IFN-γ濃度顯著低于A組(P<0.01), D組顯著高于B組、C組、E組(P<0.01);B組BALF中IL-10濃度顯著高于A組(P<0.01), D組顯著高于B組、C組、E組(p<0.01);B組TGF-β<,1>濃度著著低于A組(P<0.01),D組與B組、C組、E組比較顯著增高(P<0.01). (5)

8、肺組織GATA-3的表達(dá):小鼠肺組織切片免疫組化顯示B組肺組織中有大量細(xì)胞表達(dá),胞漿和胞核均呈棕黃色且著色較深,其陽性細(xì)胞數(shù)(29.00±7.04)顯著高于A組(6.33±2.58)(P<0.01),D組(13.83±4.70)、E組(17.67±4.84)與B組比較表達(dá)明顯增多(P<0.01).免疫印跡western-blot法顯示肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)A組顯著低于B組、C組、D組、E組(P<0.01),B組顯著高于D組、E組(

9、P<0.01),D組顯著低于C組(P<0.05). (6)肺組織T-bet的表達(dá):小鼠肺組織切片免疫組化顯示B組肺組織中T-bet陽性細(xì)胞數(shù)(5.33±3.26)顯著低于A組(27.50±7.45)(P<0.01),D組(28.50±7.18)、E組(28.33±6.25)與B組比較表達(dá)明顯增多(P<0.01).免疫印跡Western-blot法顯示肺組織中T-bet蛋白表達(dá)A組顯著高于B組(P<0.01)、C組(P<0.01)

10、、E組(P<0.05),B、組顯著低于D組、E組(P<0.05),D紕顯著高于C組(P<0.01). (7)肺組織Foxp3的表達(dá):免疫印跡Western-b101,法顯示肺組織中Foxp3的表達(dá)A組顯著高于B組(P<0.01)、C組(P<0.01)、E組(P<0.05);B組顯著低于D組(P<0.05);D組顯著高于C組(P<0.05). (8)相關(guān)分析:BALF中EOS數(shù)量與lL-4、IL-5水平呈正相關(guān),與IFN-

11、γ呈負(fù)相關(guān);肺組織GATA-3陽性細(xì)胞數(shù)與BALF中IL-4、IL-5濃度、EOS絕對值均呈正相關(guān),與IFN-γ呈負(fù)相關(guān);肺組織T-bet農(nóng)達(dá)與BALF中IFN-γ濃度呈正相關(guān),與IL-5濃度、EOS絕對值均呈負(fù)相天:腫組組織xp3的表達(dá)與T-bet、T-bet/GATA-3、IFN-γ、TGF-βl水平均呈正相關(guān),與BALF中IL-4、IL-5水平、EOS數(shù)量呈負(fù)相關(guān). 結(jié)論： (1)塵螨哮喘小鼠模型月巾組織表達(dá)GAT

12、A-3增多,而T-bet的表達(dá)減少,提示T-bet/GATA-3的平衡對支氣管哮喘的發(fā)病起著重要作用. (2)塵螨哮喘小鼠模型腫組織表達(dá)Foxp3減少,BALF中TGF-β1水平下降,提示在哮喘個體體內(nèi)存在著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的不足. (3)CpGODN能夠改善氣道炎癥,調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡,可能是通過T-bet表達(dá)增加、下調(diào)GATA-3的表達(dá)或/和通過增加Tr的產(chǎn)生、促進(jìn)IL-10和TGF-β的分泌來起到免疫調(diào)節(jié)作用的.