GFP+小鼠胚胎干細胞ESD3大鼠腦內移植的相關研究.pdf

1、目的：(1)全能(totipotent)區(qū)域非特異性(regionallynon-specified)的胚胎干細胞(embryonicstemcell，ESC)是研究成體不同腦區(qū)控制干細胞分化能力的一個十分有力的工具。為了了解成體腦組織對胚胎干細胞的影響及胚胎干細胞在成體腦內的一系列行為，我們將少量未分化小鼠胚胎干細胞移植入成體大鼠腦內幾個不同部位，以探討未分化的小鼠胚胎干(mouseembryonicstem，mES)細胞在成體大鼠大

2、腦內各個部位的存活，生長與分化的潛能的差異。 (2)在病理條件下，腦內的局部環(huán)境會發(fā)生改變，其形成的特殊環(huán)境會影響移植胚胎干細胞的行為。為了了解腦出血時的腦內環(huán)境對胚胎干細胞的影響，我們將未分化小鼠胚胎干細胞移植入腦出血大鼠模型腦內，初步研究小鼠胚胎干細胞在腦出血大鼠腦內的存活與分化。 (3)同時通過本系列實驗，可以暴露出一些在胚胎干細胞乃至其他種類干細胞移植應用研究中將面臨的問題，為進一步進行干細胞移植研究打下基礎。

3、 方法：將小鼠胚胎干細胞用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)標記，經G418篩選一月使其穩(wěn)定表達。 (1)我們將少量轉綠色熒光蛋白未分化小鼠胚胎干細胞移植入成體大鼠腦內不同部位，分別于移植后5天，14天和28天后處死大鼠，進行形態(tài)學觀察及免疫熒光定性檢測，以了解未分化小鼠胚胎干細胞在大鼠腦內不同區(qū)域的存活，生長與分化情況。 (2)制作大鼠腦出血模型，三天后移植GFP+胚胎干細胞至

4、出血灶對側側腦室內及對照健康大鼠側腦室內，一月后處死大鼠，行免疫熒光染色鑒定后，通過熒光顯微鏡觀察小鼠胚胎干細胞，了解其分化生長情況。 結果：(1)移植入完整大鼠大腦中的未分化小鼠胚胎干細胞可逐步遷徙入大鼠腦組織。移植細胞及其后裔在海馬生長最為旺盛，而隔區(qū)最差(p＜0.01)。移植細胞數量對其生存狀態(tài)有一定的影響，移植細胞數量過多，移植部位腦組織破壞重，細胞壞死多；而移植細胞數量太少則由于免疫反應的存在，保證不了最終移植物的存在

5、。移植細胞與接受移植的器官的相對體積比例也是一個重要影響因素，針對不同的疾病所需要移植的不同部位必須區(qū)別對待。 移植胚胎干細胞可向nestin-ir(immunereactive)神經干細胞分化，移植細胞分化為神經干細胞的效率也有位置差異，海馬最高，而隔區(qū)最低(p＜0.01)。 在各移植部位均發(fā)現有移植細胞來源的終末分化細胞，即神經元和膠質細胞，尤其在海馬，可見有大量的移植胚胎干細胞向神經元分化。 (2)小鼠胚胎

6、干細胞腦內移植至大鼠側腦室后能有效穿透腦室壁，進入腦組織，向病灶方向遷徙，腦出血增加了移植入側腦室的GFP+小鼠胚胎干細胞進入腦實質的數量(p＜0.01)。 因為供體細胞突破側腦室壁的部位不盡相同，并沿腦室向病灶方向遷徙，細胞分化情況很復雜。我們發(fā)現對照組分化較為明顯，尤其是遷移入海馬組織的可高比例的分化為nestin-ir細胞；相反卒中組移植細胞則多無神經相關標記的表達，存活細胞周圍可見大量宿主來源的反應性星型膠質細胞。遷移至

7、病灶周圍的細胞也有分化為nestin-ir的。在nestin-ir細胞分布區(qū)還間雜著數量不等的NeuN+(neuronalnucleiprotein)與GFAP+(glialfibrillaryacidicprotein)的移植細胞，即移植細胞可向神經元與神經膠質細胞等終末細胞分化。 結論：(1)只有部分腦區(qū)構成適合胚胎干細胞及其后裔生存，并促進其分化的有益環(huán)境。因此，位置特異的微環(huán)境因子及環(huán)境對移植細胞的影響，凸現了宿主組織特