攜GDNF基因的質(zhì)粒黏附縫線促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是目前常見的骨科損傷。周圍神經(jīng)損傷后痊愈的可能性較小，常導(dǎo)致肢體功能障礙，直接影響患者的生活質(zhì)量。近幾十年來(lái)，周圍神經(jīng)損傷后再生修復(fù)的研究非?；钴S，其中基因治療是目前研究的熱點(diǎn)并取得了一定的效果。這之中，相當(dāng)一部分研究以神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NTFS)影響周圍神經(jīng)再生為研究對(duì)象。NTFS是一類來(lái)源不同但具有相似作用的蛋白類生物大分子，它們的作用是維護(hù)神經(jīng)元的生存并促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。NTFS主要存在于神經(jīng)支配的外周靶器官及其它被神經(jīng)支配

2、的結(jié)構(gòu)，例如肌肉、感覺效應(yīng)器以及遠(yuǎn)側(cè)的神經(jīng)干，這些結(jié)構(gòu)中的營(yíng)養(yǎng)因子由神經(jīng)終未攝取，通過(guò)軸漿逆行運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)細(xì)胞胞體，從而發(fā)揮其支持和營(yíng)養(yǎng)作用。NTFS包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)生長(zhǎng)因子(GGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、白血病抑制因子(UF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)等等。膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)

3、并已被克隆純化的一種高效能的營(yíng)養(yǎng)因子。研究證實(shí)，GDNF對(duì)中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動(dòng)、感覺神經(jīng)元，自主神經(jīng)元均有相同的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)元再生和免受外界損傷引起的凋亡及促進(jìn)存活作用。GDNF通過(guò)靶源性和局部性兩種方式表達(dá)其生物活性。我們的研究的目的是模擬坐骨神經(jīng)離斷動(dòng)物模型，利用GDNF對(duì)神經(jīng)元保護(hù)并促進(jìn)其生長(zhǎng)的特點(diǎn)，以縫線作為載體轉(zhuǎn)化入損傷的神經(jīng)組織，在不同的時(shí)間點(diǎn)觀察外源性GDNF基因通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)周圍神經(jīng)損傷后的保護(hù)作用及對(duì)神

4、經(jīng)功能康復(fù)的影響，為臨床治療周圍神經(jīng)損傷開辟新途徑提供科學(xué)的理論依據(jù)。 一、DNA3-G1)NF-GFP質(zhì)粒DNA的抽提與純化 L目的：抽提與純化PcDNA3一GDNF-GFP質(zhì)粒DNA，用于觀察對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)離斷損傷的治療和保護(hù)作用。 2．方法：挑取含有PcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a菌落，接種在2500ml含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，采用Qiagen公司的Endofr

5、eePlasmidGiga試劑盒以堿裂解法對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒DNA的抽提與純化。 3．結(jié)果：對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳，并與標(biāo)準(zhǔn)Marker比較顯示為6．0kb大小片段，與預(yù)期結(jié)果一致。 二、質(zhì)粒黏附縫線的制備及檢測(cè) 1.目的：制備質(zhì)粒黏附縫線，觀察質(zhì)粒的黏附及釋放情況。 2．方法：①左旋多聚賴氨酸(O．1mg/m1)與質(zhì)粒進(jìn)行等體積混合使終濃度為1．75mg／ml。將10／0prolene線浸泡于此混合溶液中，

6、24h后取出晾干，再浸泡于此溶液中24h，反復(fù)3次，共浸泡72h。將浸泡過(guò)的縫線置于消毒的eppendorf管內(nèi)，存放于低溫冰箱中備用。②將8根lcm的縫線分別置于1．0mi的生理鹽水中37℃水浴振蕩，分別于1、2、4、6、12、24、36、72h時(shí)取其溶液在紫外分光光度計(jì)下測(cè)其濃度。 3．結(jié)果：八份溶液經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，見隨著時(shí)間的延長(zhǎng)泳帶亮度逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明其釋放量逐漸增多。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，見其于36h達(dá)到峰值濃度2

7、．5gg／ml。 三、質(zhì)粒黏附縫線對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)離斷損傷修復(fù)的影響 L目的：應(yīng)用帶有PcDNA3一GDNF-GFP質(zhì)粒DNA的縫線縫合修復(fù)大鼠離斷坐骨神經(jīng)，觀察質(zhì)粒DNA的釋放、轉(zhuǎn)染，探討GDNF對(duì)周圍神經(jīng)的保護(hù)作用。 2．方法：①雌性SD大鼠，體重250g左右，作左臀部斜切口，顯露坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣0．5cm處將其切斷，用8針l0／0prolene縫線將神經(jīng)外膜端端對(duì)線縫合。②實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組：一組以帶有P

8、cDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒DNA的縫線縫合修復(fù)；一組以帶pcDNA3的縫線縫合修復(fù)。③術(shù)后3d、l5d、4w、8w分別對(duì)3組大鼠進(jìn)行熒光檢測(cè)，以出現(xiàn)綠色熒光標(biāo)志物為轉(zhuǎn)染成功。④術(shù)后12w取L4-L6節(jié)段的脊髓行尼氏染色，比較神經(jīng)元數(shù)目。⑤術(shù)后2w、4w、6w、8w、lOw、12w分別對(duì)3組大鼠進(jìn)行大體觀察并進(jìn)行坐骨神經(jīng)指數(shù)檢測(cè)。⑥術(shù)后12w行肌肉濕重，相對(duì)肌纖維截面積測(cè)定。⑦術(shù)后1w、8w于坐骨神經(jīng)吻合處切片行免疫組化檢測(cè)并進(jìn)行圖

9、像分析。⑥術(shù)后12w大鼠行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)誘發(fā)電位峰值、傳導(dǎo)速度測(cè)定后處死，取標(biāo)本行吻合處的超薄切片透射電鏡下觀察，標(biāo)本吻合處再生軸突數(shù)目和面積的圖像分析處理。 3．結(jié)果：①術(shù)后1w，鏡下觀察冰凍切片證實(shí)坐骨神經(jīng)有綠色熒光標(biāo)記，證明轉(zhuǎn)染成功。②尼氏染色發(fā)現(xiàn)，pcDNA3一GDNF-GFP組的神經(jīng)元數(shù)目多于pcDNA3組③pcDNA3-GDNF-GFP組的坐骨神經(jīng)指數(shù)明顯高于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④術(shù)后12w發(fā)現(xiàn)，pcDNA3-GDN

10、F-GFP組肌肉濕重，相對(duì)肌纖維截面積明顯好于pcDNA3組⑤免疫組化發(fā)現(xiàn)損傷1w后pcDNA3一GDNF-GFP組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于pcDNA3組，損傷8w后仍見明顯陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。④術(shù)后12w，pcDNA3-GDNF-GFP組的動(dòng)作電位峰值、傳導(dǎo)速度高于對(duì)照組，標(biāo)本吻合處再生軸突數(shù)目和面積也明顯多于對(duì)照組。 四、結(jié)論 1．順利的抽提與純化出PcDNA3-GDNF-GFP質(zhì)粒DNA，為實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。 2．制