FXR調(diào)控下Bsep和Ntcp在高脂血癥大鼠膽固醇代謝中的作用機(jī)制.pdf

1、目的:本研究通過(guò)建立高脂血癥大鼠模型,以法尼基衍生物X受體(FXR)和FXR的靶基因-肝臟中小膽管側(cè)肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜上分布的膽鹽輸出泵(bile salt export pump,BSEP／Bsep),肝細(xì)胞血竇面基底膜上的?；悄懰徕c轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium／taurocholate cotransportingpolypeptide,NTCP／Ntcp)為研究對(duì)象,探討在FXR調(diào)控下Bsep和Ntcp在高脂血癥大鼠膽汁酸及膽固醇代謝中的

2、作用及與高脂血癥形成的相關(guān)性,為防治高脂血癥提供新的依據(jù)和分子理論基礎(chǔ),有望為治療膽汁酸代謝紊亂及相關(guān)性疾病提供一種新的思路。
　　 方法:取wistar大鼠(雄性、體重144±8.2g)60只,隨機(jī)分為2組,每組30只:普通飲食對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照組)、高脂飲食實(shí)驗(yàn)組(簡(jiǎn)稱(chēng)實(shí)驗(yàn)組)。對(duì)照組予以普通飲食,實(shí)驗(yàn)組予以高脂飲食(配方為:在基礎(chǔ)飼料中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04膽固醇、0.1豬油、0.05蔗糖、0.005膽酸鈉、0.002丙基硫

3、氧嘧啶),喂食90天,建立高脂血癥模型,定期取血用自動(dòng)生化儀檢測(cè)膽固醇含量,8～12周監(jiān)測(cè)血膽固醇水平,觀察建模是否達(dá)到要求。兩組入選大鼠均需排除己飲用含其它類(lèi)藥物飲食、高脂血癥、糖尿病、畸形等疾病存在。建模成功后,所用實(shí)驗(yàn)方法分為以下兩個(gè)環(huán)節(jié):1.取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組肝臟組織的RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-polymerase chain reaction；RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)兩組模型肝臟組織的FXR,Bsep和Ntcp基因表

4、達(dá)的強(qiáng)度；2.取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組肝臟組織,石蠟切片后用免疫組化SP(streptavidin-perosidase)法檢測(cè)兩組模型肝臟組織的FXR,Bsep和Ntcp表達(dá)的強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS14.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.電泳結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)中肝臟組織擴(kuò)增產(chǎn)物都出現(xiàn)了內(nèi)參β-actin基因的425bp擴(kuò)增帶和FXR,Bsep及Ntcp基因的283bp,28

5、9bp,325bp擴(kuò)增帶,實(shí)驗(yàn)組FXR基因及其調(diào)控下的Bsep基因擴(kuò)增帶亮度均強(qiáng)于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組Ntcp基因擴(kuò)增帶亮度弱于對(duì)照組。半定量結(jié)果分析:利用Quantity One軟件計(jì)算比較每一泳道中PCR產(chǎn)物條帶的光密度值,計(jì)算FXR,Bsep及Ntcp基因與β-actin條帶的光密度的相對(duì)比值,通過(guò)比較各樣本FXR,Bsep及Ntcp基因的相對(duì)值,最終得出FXR,Bsep及Ntcp基因在肝臟組織中mRNA表達(dá)的相對(duì)含量。半定量結(jié)果的相對(duì)

6、光密度值需每組每一實(shí)驗(yàn)對(duì)象同等處理?xiàng)l件下均重復(fù)測(cè)定3次,取其最終平均值作為統(tǒng)計(jì)用數(shù)據(jù)。最后結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組大鼠FXR,Bsep基因mRNA表達(dá)高于對(duì)照組(0.8519±0.0270,t=65.398 P<0.05),(0.8641±0.0221,t=61.110 P<0.05),對(duì)照組大鼠Ntcp基因mRNA表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)組(0.8645±0.0204,t=61.945 P<0.05)。三種基因表達(dá)均出現(xiàn)差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.免疫組化S

7、P(streptavidin-perosidase)法結(jié)果顯示:在高倍顯微鏡鏡下肝臟組織中出現(xiàn)黃色染色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野內(nèi)觀察100個(gè)細(xì)胞,陽(yáng)性細(xì)胞≥10％為陽(yáng)性,否則為陰性,利用四格表的Fisher確切概率法檢驗(yàn)。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組FXR,Bsep,Ntcp表達(dá)陽(yáng)性率為75％,76.7％,24.5％；對(duì)照組FXR,Bsep,Ntcp表達(dá)陽(yáng)性率為17.3％,18.5％,71％。它們之間的差異有顯著性,存在統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)意義FXR(X2=10.932 P<0.05),Bsep(X2=10.773 P<0.05),Ntcp(X2=9.759P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.實(shí)驗(yàn)組大鼠的FXR基因mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加。2.實(shí)驗(yàn)組大鼠FXR調(diào)控下的Bsep基因mRNA表達(dá)高于對(duì)照組,Ntcp基因mRNA的表達(dá)低于對(duì)照組。故高脂血癥時(shí),肝臟膽汁酸排泄率增加,攝取率減少,減慢高脂血癥的形成,減輕肝臟的負(fù)擔(dān),維護(hù)肝臟的功能。3.作為FXR的靶