Ntcp、Bsep、Mdr2蛋白改變致膽汁失衡在大鼠自體肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、背景
　　 肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥是影響患者長(zhǎng)期存活及導(dǎo)致移植物功能受損的最主要因?yàn)橹?因此被肝移植先驅(qū)Roy Calne稱(chēng)之為“阿喀琉斯之踵”。目前以彌漫性或局灶性的移植物膽管樹(shù)狹窄、擴(kuò)張、毀損及管型形成為病理特征的缺血性膽管病變(ITBL)被認(rèn)為是非外科性移植物膽管樹(shù)損害的主要因?yàn)椤Ｈ毖俟嘧p傷是供肝膽管必須經(jīng)歷的病理生理過(guò)程,也是導(dǎo)致移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要因?yàn)橹?。在肝移植過(guò)程中,供肝膽道需要經(jīng)歷短暫的熱缺血損傷,冷保

2、存損傷,膽道相對(duì)熱缺血損傷(又稱(chēng)為膽道二次熱缺血損傷)、再灌注損傷等過(guò)程。目前肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷越來(lái)越受到研究者的重視,但其機(jī)制目前還不十分明了。
　　 膽鹽在膽道缺血再灌注損傷中起著重要的協(xié)同作用。已有研究證實(shí),供肝熱缺血、冷保存時(shí)間的延長(zhǎng)都可使膽鹽比例相對(duì)增加,而具有膽道保護(hù)作用的磷脂比例相對(duì)減少。疏水性膽鹽的“去垢”作用可誘導(dǎo)正常膽道上皮細(xì)胞的死亡或凋亡。由于肝動(dòng)脈血供對(duì)移植肝膽汁分泌功能的正?；謴?fù)非常重要,因此我們

3、推測(cè),在臨床肝移植中,如果肝動(dòng)脈開(kāi)放時(shí)間延遲,那么術(shù)后早期分泌的膽汁也可能出現(xiàn)類(lèi)似的變化,加重膽道損傷。
　　 鑒于此,本課題建立大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型,分別在門(mén)靜脈開(kāi)放0min、30min及60min后開(kāi)放肝動(dòng)脈,造成不同程度的膽道相對(duì)熱缺血。引流術(shù)后早期分泌的膽汁,檢測(cè)其中的膽鹽、磷脂濃度及其比例,以及對(duì)膽汁影響較大的親水性膽鹽及疏水性膽鹽的摩爾分?jǐn)?shù),以探討膽道相對(duì)熱缺血是否會(huì)引起術(shù)后早期膽汁成分的失衡,以及這種膽

4、汁是否會(huì)導(dǎo)致或加重膽道損傷。膽鹽及磷脂的分泌依賴(lài)于肝細(xì)胞膜上的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2,因此我們還檢測(cè)了這三種蛋白在肝組織中的表達(dá)情況,以求初步探討膽道相對(duì)熱缺血引起膽汁失衡的機(jī)理。
　　 第一部分 大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型的建立
　　 目的
　　 建立大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型,要求該模型既可模擬臨床肝移植的過(guò)程,又能精確控制膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間,還能夠引流出膽汁以便于檢測(cè)膽汁成分

5、的變化。
　　 方法
　　 選用8周齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠35只,雌雄不限,體重280～300g。實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)階段進(jìn)行,其中預(yù)實(shí)驗(yàn)15例,系手術(shù)技巧及方法的練習(xí)；正式實(shí)驗(yàn)20例。手術(shù)操作步驟如下:①游離肝臟周?chē)g帶、肝上、肝下下腔靜脈,門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈及肝外膽道。②穿刺門(mén)靜脈并肝素化。③使用4℃含肝素(12.5U/ml)的乳酸鈉林格氏液行腹主動(dòng)脈及門(mén)靜脈雙重恒壓冷灌注。④灌注滿(mǎn)意后,修補(bǔ)門(mén)靜脈、腹主動(dòng)脈穿刺點(diǎn)以及下腔

6、靜脈的灌注液流出通道,開(kāi)放門(mén)靜脈血液灌注,結(jié)束無(wú)肝期。⑤門(mén)靜脈開(kāi)放60min后恢復(fù)肝動(dòng)脈灌注。⑥建立膽道外引流通道:用兩段硬膜外導(dǎo)管進(jìn)行膽總管插管及上段空腸造瘺,兩段導(dǎo)管在體外經(jīng)軟塑料導(dǎo)管相連接,建立膽汁回流通路。
　　 結(jié)果
　　 1.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,手術(shù)成功率為66.7％(10/15),5天存活率為53.3％(8/15)；在正式實(shí)驗(yàn)中,手術(shù)成功率95％(19/20),術(shù)后5天存活率為85％(17/20)。
　　

7、2.在正式試驗(yàn)中,平均熱缺血時(shí)間2.756±0.204min,冷灌注時(shí)間為8min,無(wú)肝期為16.200±0.630min。
　　 3.門(mén)靜脈和腹主動(dòng)脈雙重恒壓冷灌注效果好,肝臟灌注均勻；開(kāi)放血流灌注后,肝臟復(fù)流良好；術(shù)后膽汁外引流通暢。
　　 4.本模型除了血管吻合外,基本模擬了肝移植的操作過(guò)程；本模型排除了排斥反應(yīng)、免疫因素等可能對(duì)膽道造成的影響,可以精確控制門(mén)靜脈及肝動(dòng)脈的開(kāi)放時(shí)間。
　　 5.手術(shù)失敗的因

8、為主要包括:肝臟游離時(shí)操作不慎引起大出血或?qū)е職庑?穿刺及修補(bǔ)血管失敗,膽總管插管失敗,無(wú)肝期不耐受。術(shù)后并發(fā)癥主要有:膽總管插管刺破膽管壁所引起的膽漏,引流管牽拉導(dǎo)致膽總管扭曲、梗阻,腹腔感染。
　　 結(jié)論
　　 大鼠自體原位肝移植膽道外引流模型能夠精確控制膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間,可隨時(shí)觀(guān)測(cè)膽汁變化而不干擾正常的膽汁酸腸肝循環(huán),是研究肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷及術(shù)后膽汁變化的理想模型。
　　 第二部分 膽汁成分失衡在

9、大鼠自體原位肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷中的作用
　　 目的
　　 檢測(cè)經(jīng)歷過(guò)不同膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間的大鼠自體原位移植肝在術(shù)后早期分泌的膽汁中膽鹽、磷脂濃度及膽鹽/磷脂比例的變化,以及膽汁中主要親水性及疏水性膽鹽摩爾分?jǐn)?shù)的變化情況；觀(guān)察大鼠移植肝膽道損傷情況,探討膽汁成分變化與膽道損傷的相關(guān)性,從“膽汁失衡”的角度揭示肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷的機(jī)制。
　　 方法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)
　　 8周

10、齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠128只,雌雄不限,體重280～300g,隨機(jī)分為4組,每組32只:Ⅰ組為假手術(shù)組,Ⅱ組為膽道相對(duì)熱缺血0min組,Ⅲ組為膽道相對(duì)熱缺血30min組；Ⅳ組為膽道相對(duì)熱缺血60min組。每一組又隨機(jī)分為4個(gè)亞組:a、b、c、d組分別在術(shù)后第0(即術(shù)后立即采集)、1、3、5天的同一時(shí)刻采集標(biāo)本。
　　 2.觀(guān)察指標(biāo)及方法
　　 (1)大鼠膽汁中總膽汁酸鹽(TBA)濃度檢測(cè)采用循環(huán)酶法,磷脂(PL)

11、濃度檢測(cè)采用酶顯色法,谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶采用連續(xù)檢測(cè)法。
　　 (2)采用反相高效液相色譜分析檢測(cè)膽汁中親水性膽鹽TβMC、THDC及疏水性膽鹽TC、TDC的摩爾濃度,并計(jì)算四種膽鹽的摩爾分?jǐn)?shù)。
　　 (3)取肝門(mén)部膽道制作石蠟切片,HE染色,于光鏡下觀(guān)察膽道組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。參照Hertl等的方法并加以改進(jìn),對(duì)肝門(mén)部膽管損傷程度進(jìn)行分級(jí):0級(jí),膽管粘膜上皮細(xì)胞和粘膜下腺體上皮細(xì)胞正常(記0分)；1級(jí),損傷局限在

12、粘膜上皮層,膽管粘膜上皮細(xì)胞有散在性固縮、壞死、脫落,其數(shù)量不足粘膜上皮細(xì)胞總數(shù)的10％,粘膜下腺體正常(記1分)；2級(jí),10％-30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞固縮、壞死、脫落,10％以下的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落(記2分)；3級(jí),超過(guò)30％的膽管粘膜上皮細(xì)胞壞死、脫落,10％-30％的粘膜下腺體上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落(記3分)。
　　 (4)取肝門(mén)部膽道制作電鏡切片,在透射電鏡下觀(guān)察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。用Imagepro圖像

13、分析軟件進(jìn)行定量分析,求出每張照片中所有線(xiàn)粒體平均體積(V)-代表線(xiàn)粒體腫脹程度,說(shuō)明線(xiàn)粒體受損情況；膽管上皮細(xì)胞微絨毛的面積密度(AMV)-代表膽管上皮細(xì)胞表面微絨毛的覆蓋面積,說(shuō)明上皮細(xì)胞微絨毛脫落程度。
　　 (5)TUNEL法檢測(cè)肝門(mén)部膽道上皮細(xì)胞的凋亡情況。每張切片高倍光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機(jī)選取10個(gè)視野,計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞總數(shù),以凋亡細(xì)胞總數(shù)/細(xì)胞總數(shù)計(jì)算出凋亡細(xì)胞百分率,作為凋亡指數(shù)(AI)。
　　

14、 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析,組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(yàn)(LSD-t)或Tamhane's T2檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用雙變量相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論
　　 隨著膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間的延長(zhǎng),膽汁酸鹽和磷脂分泌功能下降,且下降程度不一致,術(shù)后恢復(fù)也不同步,從而導(dǎo)致術(shù)后早期

15、膽鹽/磷脂比例升高；術(shù)后早期膽汁中疏水性膽鹽的比例也呈增高趨勢(shì)。膽汁成分失衡與膽道損傷程度密切相關(guān),是肝移植膽道相對(duì)熱缺血損傷的機(jī)制之一。
　　 第三部分 大鼠自體原位肝移植膽道相對(duì)熱缺血對(duì)肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2的影響
　　 目的
　　 檢測(cè)經(jīng)歷過(guò)不同膽道相對(duì)熱缺血時(shí)間的大鼠自體原位移植肝的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2在肝組織中的表達(dá)水平,初步探討肝移植膽道相對(duì)熱缺血引起膽汁成分

16、失衡的機(jī)制。
　　 方 法
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)
　　 8周齡健康、SPF級(jí)純系SD大鼠18只,隨機(jī)分為3組,每組6只:A組為假手術(shù)組,B組為膽道相對(duì)熱缺血0min組,C組為膽道相對(duì)熱缺血60min組。在術(shù)后第3天采集肝臟標(biāo)本。
　　 2.觀(guān)察指標(biāo)及方法
　　 Western Blotting及免疫組織化學(xué)染色觀(guān)測(cè)肝臟肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ntcp、Bsep、Mdr2在組織中的表達(dá)情況。