樹突狀細胞表面新型熱休克蛋白Hsp70L1相關受體的尋找和確證.pdf

1、Hsp70L1是我們從人樹突狀細胞cDNA文庫中發(fā)現的一個新分子，與HSP70家族成員具有高度同源性。重組Hsp70L1蛋白能誘導DC成熟并表達IL-10p70，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，TNF-α和IL-1β等細胞因子和趨化因子；同時具有佐劑樣效應，增強抗原特異性的細胞免疫應答。本研究旨在發(fā)現并鑒定DC表面Hsp70L1蛋白相關受體，通過研究Hsp70L1與相關受體作用的分子機制來闡明其發(fā)揮佐荊效應的原理。首先我們表達

2、純化了GST-Hsp70L1融合蛋白，通過GST Pull-Down技術，尋找能與其結合的DC膜蛋白，Western-Blot結果表明TLR2、TLR4和Lox-1能與Hsp70L1在體外結合；在此基礎上，通過受體表達克隆，篩選出穩(wěn)定表達HSP70蛋白家族受體CD40，CCR5，Lox-1的HEK293細胞表達株，觀察與Hsp70L1蛋白的結合情況。結果顯示TLR4和CD40能與Hsp70L1結合，CCR5和LOX-1不與HSP70L1

3、結合；隨后研究了TLR4與Hsp70L1蛋白之間相互作用的生物學效應，結果表明：Hsp70L1可以誘導野生型小鼠，但不能誘導TLR4缺陷小鼠DC的表型改變和炎性因子TNF-α和IL-1β表達，HSP70L1可以在野生小鼠模型，但不能在TLR4小鼠模型上介導CEA特異性細胞免疫應答增強；采用人TLR4抑制劑可以明顯抑制HSP70L1介導的CEA抗原負載的人DC誘導特異細胞免疫應答的能力。HSP70L1與TLR4作用后的信號轉導的研究表明其

4、活化了MAPK和NF-κB級聯信號通路。從而證實了TLR4是Hsp70L1誘導DC成熟表型改變和炎性因子表達以及誘導特異性的T細胞應答的一個關鍵的功能受體。這些結果為Hsp70L1的免疫佐劑功能的研究提供了理論基礎。 本研究在以前的研究基礎上，采用GST Pull Down和克隆受體表達這兩種方法，從分子和細胞兩個層面尋找并確定DC表面能夠與HSP70L1蛋白結合的受體。并通過Hsp70L1蛋白與這些受體作用后的功能檢測，進一步

5、研究能夠與Hsp70L1結合的受體與其作用后誘導相關的生物學功能，通過探討Hsp70L1與相關受體作用的分子機制和途徑來闡明其發(fā)揮佐劑效應的原理。研究分為三個部分進行。 第一部分：GST-Hsp70L1融合蛋白原核表達載體構建表達、純化及其與DC膜蛋白的作用研究 GST Pull-Down技術通常用于從蛋白質混合液中親和純化某一未知蛋白，未知蛋白與GST融合表達后，再利用GST與偶聯有谷胱甘肽的珠子或層析柱的結合，將與

6、GST融合的未知蛋白從蛋白質混合液中分離出來。GST Pull-Down一般有兩個用途：其一是用來鑒定某一GST融合蛋白與未知蛋白的相互作用；其二是用來鑒定某一GST融合蛋白與一個推測可能與其有相互作用的已知蛋白之間的相互作用。我們主要是采用其第一種用途來確證Hsp70L1蛋白在DC細胞膜上的受體。 我們采用了GST Pull-Down的方法研究Hsp70L1蛋白與DC細胞膜蛋白之間的作用。從本室構建的含有HSP70L1 cDN

7、A的全部編碼區(qū)序列的重組載體pVax-Hsp70L1質粒，采用Bam HⅠ和XhoⅠ酶切，獲得Hsp70L1 cDNA的完整編碼框，插入pGEX-4T-2表達載體，表達N端帶有GST標簽的GST-Hsp70L1重組蛋白。篩選到經過酶切和測序確認的正確重組表達質粒后，轉化大腸桿菌BL21。轉化子在LB培養(yǎng)基中，用IPTG誘導表達，SDS-PAGE觀察到約80kD的重組蛋白表達，主要出現在細菌包涵體中。經過8M尿素變性增溶和稀釋復性后，再通

8、過陰離子交換柱及GST蛋白純化柱分離純化后我們得到了純度約為90％的GST-Hsp70L1融合蛋白。 Hsp70L1蛋白與HSP70蛋白家族的其他蛋白具備高同源性，這揭示了Hsp70L1蛋白可能與其他HSP70蛋白在DC細胞膜上享有共同的受體。故我們采用Western-blot方法檢測GST pull-down洗脫下的蛋白與CD40，CCR5，LOX-1及TLR2/4這些已知的HSP蛋白受體的抗體結合情況。結果顯示GST-Hsp

9、70L1融合蛋白-磁珠組中檢測出TLR2、TLR4及LOX-1這三種受體蛋白，而GST蛋白與磁珠結合組及空白磁珠組這兩對照組均未見這三種受體，說明Hsp70L1蛋白能夠特異與這三種受體結合，提示TLR2、TLR4及LOX-1都可能是HSP70L1的受體。 第二部分：DC表面HSP70家族相關受體的克隆及穩(wěn)定表達細胞株的建立及與Hsp70L1蛋白結合檢測 在GST Pull-Down體外結合實驗結果的基礎上，我們采用克隆受

10、體表達這一策略，研究這些HSP家族相關受體與Hsp70L1蛋白在細胞表面的結合情況。 抽提FHP-1細胞的總RNA，通過RT-PCR．克隆出人CD40，CCR5和LOX-1分子，連接至測序載體p-GEMT上，經過測序核實后用內切酶切下目的分子，將其分別連接到真核表達載體pCDNA3.1/myc-His(-)B上。用脂質體轉染試劑Lip2000將這些重組表達質粒轉染至HEK293細胞，并經過G418篩選4周以上得到穩(wěn)定表達這些受體

11、的細胞株。 在此基礎上采用流式細胞儀及激光共聚焦顯微鏡直接檢測穩(wěn)定表達細胞與FITC標記的Hsp70L1蛋白與其的結合情況。流式細胞儀結果顯示，與對照的293細胞相比，FITC標記的Hsp70L1蛋白能明顯與穩(wěn)定表達CD40和TLR4的293細胞結合；激光共聚焦顯微鏡結果顯示，FITC標記的Hsp70L1蛋白都結合在穩(wěn)定表達TLR4的293細胞表面，而對照293細胞則未能觀察到此現象。這也驗證了TLR4受體在GST Pull-D

12、own體外結合實驗的結果，同時發(fā)現CD40可能也是Hsp70L1蛋白的受體。 第三部分：Hsp70L1蛋白與TLR4受體作用的功能研究 根據前一部分和第二部分的實驗結果，我們重點選擇了TLR4這個受體，研究并探求其與Hsp70L1蛋白與TLR4結合后引起的生物學功能，確定其相互作用的生理意義和影響，為Hsp70L1的免疫佐劑效應提供基礎原理。 結果表明，C57BL/6 TLR4缺陷小鼠骨髓來源的DC與Hsp70L

13、1蛋白作用后，其表面成熟標志分子CD40、CD80和I-ab的表達水平無明顯改變，明顯低于HSP70L1蛋白刺激的正常小鼠DC，而HSP70L1刺激的正常小鼠DC，其CD40、CD80的表達明顯增高；HSP70L1刺激的TLR4缺陷小鼠DC誘導促炎性細胞因子TNF-α和IL-1β表達無明顯改變，明顯低于正常小鼠，而HSP70L1刺激的正常小鼠DCTNF-α和IL-1β表達明顯增高；在誘導特異性T細胞應答方面，HSP70L1不能誘導TLR

14、4缺陷組小鼠的脾細胞CEA特異性免疫應答的增強，而可以在正常小鼠DC組誘導小鼠的脾細胞CEA特異性免疫應答的增強。而且HSP70L1具有高效免疫佐劑效應，在人體外體外致敏人外周血單核細胞來源的DC后體外誘導特異性的T淋巴細胞實驗中，采用人TLR4抑制劑可以明顯抑制HSP70L1介導的CEA抗原負載的人DC誘導特異T細胞免疫應答的能力。 Hsp70L1刺激293-TLR4細胞后信號通路活化研究結果顯示：Hsp70L1與TLR4作

15、用后能引起細胞內IκB-α的磷酸化和NF-κB的活化，同時激活JNK和P38，ERK和IKKMAPK級聯信號通路。進一步闡明了Hsp70L1與TLR4作用的分子機制。 以上結果表明：Hsp70L1蛋白通過TLR4介導促進DC細胞成熟表型改變與誘導促炎性細胞因子的表達以及DC向T細胞遞呈抗原，誘導特異性的T細胞應答，從而確證了TLR4是Hsp70L1蛋白的受體。通過研究TLR4與Hsp70L1蛋白作用后促進DC功能的研究，為如何提

16、高Hsp70L1蛋白的免疫佐劑功能的及Hsp70L1蛋白在免疫治療上的應用提供了重要的理論依據。 結論： 1．構建了pGEX-4T-2-Hsp70L1重組質粒，通過Source15Q離子交換柱和GSTrapTMFF柱純化了GST-Hsp70L1融合蛋白。GST-Hsp70L1蛋白與膜蛋白經過GST Pull-Down作用后結果顯示，在體外條件下與TLR2、TLR4及Lox-1能夠和GST-Hsp70L1蛋白結合；

17、 2．克隆了CD40、CCR5和Lox-1的cDNA連接至真核表達質粒pCDNA3.1/myc-His(-)B中，建立和篩選了穩(wěn)定表達CD40、CCR5和Lox-1的HEK293細胞，通過FITC標記的Hsp70L1蛋白與穩(wěn)定表達受體細胞的作用，證明hsp70L1能夠與穩(wěn)定表達TLR4、CD40的HEK293細胞結合，而不與對照HEK293細胞結合。 3．證明了TLR4是Hsp70L1誘導DC表型成熟和炎性因子表達以及誘導特異性

18、的T細胞應答的功能受體之一。Hsp70L1能夠促進DC表面CD40，CD80的表達和促炎性細胞因子TNF-α、IL-β的分泌，而且CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏DC誘導抗原特異性T細胞是由TLR4介導的Hsp70L1與DC相互作用引起的。 4．HSP70L1與TLR4的信號通路研究表明：Hsp70L1與TLR4作用后能引起細胞內IκB-α的磷酸化和NF-κB的活化，同時磷酸化JNK和P38，ERK和IKK來活化