樹(shù)突狀細(xì)胞表面新型熱休克蛋白Hsp70L1相關(guān)受體的尋找和確證.pdf

1、Hsp70L1是我們從人樹(shù)突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新分子，與HSP70家族成員具有高度同源性。重組Hsp70L1蛋白能誘導(dǎo)DC成熟并表達(dá)IL-10p70，MIP-1α，MIP-1β，RANTES，TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子和趨化因子；同時(shí)具有佐劑樣效應(yīng)，增強(qiáng)抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究旨在發(fā)現(xiàn)并鑒定DC表面Hsp70L1蛋白相關(guān)受體，通過(guò)研究Hsp70L1與相關(guān)受體作用的分子機(jī)制來(lái)闡明其發(fā)揮佐荊效應(yīng)的原理。首先我們表達(dá)

2、純化了GST-Hsp70L1融合蛋白，通過(guò)GST Pull-Down技術(shù)，尋找能與其結(jié)合的DC膜蛋白，Western-Blot結(jié)果表明TLR2、TLR4和Lox-1能與Hsp70L1在體外結(jié)合；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)受體表達(dá)克隆，篩選出穩(wěn)定表達(dá)HSP70蛋白家族受體CD40，CCR5，Lox-1的HEK293細(xì)胞表達(dá)株，觀察與Hsp70L1蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果顯示TLR4和CD40能與Hsp70L1結(jié)合，CCR5和LOX-1不與HSP70L1

3、結(jié)合；隨后研究了TLR4與Hsp70L1蛋白之間相互作用的生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果表明：Hsp70L1可以誘導(dǎo)野生型小鼠，但不能誘導(dǎo)TLR4缺陷小鼠DC的表型改變和炎性因子TNF-α和IL-1β表達(dá)，HSP70L1可以在野生小鼠模型，但不能在TLR4小鼠模型上介導(dǎo)CEA特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答增強(qiáng)；采用人TLR4抑制劑可以明顯抑制HSP70L1介導(dǎo)的CEA抗原負(fù)載的人DC誘導(dǎo)特異細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。HSP70L1與TLR4作用后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究表明其

4、活化了MAPK和NF-κB級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。從而證實(shí)了TLR4是Hsp70L1誘導(dǎo)DC成熟表型改變和炎性因子表達(dá)以及誘導(dǎo)特異性的T細(xì)胞應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵的功能受體。這些結(jié)果為Hsp70L1的免疫佐劑功能的研究提供了理論基礎(chǔ)。 本研究在以前的研究基礎(chǔ)上，采用GST Pull Down和克隆受體表達(dá)這兩種方法，從分子和細(xì)胞兩個(gè)層面尋找并確定DC表面能夠與HSP70L1蛋白結(jié)合的受體。并通過(guò)Hsp70L1蛋白與這些受體作用后的功能檢測(cè)，進(jìn)一步

5、研究能夠與Hsp70L1結(jié)合的受體與其作用后誘導(dǎo)相關(guān)的生物學(xué)功能，通過(guò)探討Hsp70L1與相關(guān)受體作用的分子機(jī)制和途徑來(lái)闡明其發(fā)揮佐劑效應(yīng)的原理。研究分為三個(gè)部分進(jìn)行。 第一部分：GST-Hsp70L1融合蛋白原核表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)、純化及其與DC膜蛋白的作用研究 GST Pull-Down技術(shù)通常用于從蛋白質(zhì)混合液中親和純化某一未知蛋白，未知蛋白與GST融合表達(dá)后，再利用GST與偶聯(lián)有谷胱甘肽的珠子或?qū)游鲋慕Y(jié)合，將與

6、GST融合的未知蛋白從蛋白質(zhì)混合液中分離出來(lái)。GST Pull-Down一般有兩個(gè)用途：其一是用來(lái)鑒定某一GST融合蛋白與未知蛋白的相互作用；其二是用來(lái)鑒定某一GST融合蛋白與一個(gè)推測(cè)可能與其有相互作用的已知蛋白之間的相互作用。我們主要是采用其第一種用途來(lái)確證Hsp70L1蛋白在DC細(xì)胞膜上的受體。 我們采用了GST Pull-Down的方法研究Hsp70L1蛋白與DC細(xì)胞膜蛋白之間的作用。從本室構(gòu)建的含有HSP70L1 cDN

7、A的全部編碼區(qū)序列的重組載體pVax-Hsp70L1質(zhì)粒，采用Bam HⅠ和XhoⅠ酶切，獲得Hsp70L1 cDNA的完整編碼框，插入pGEX-4T-2表達(dá)載體，表達(dá)N端帶有GST標(biāo)簽的GST-Hsp70L1重組蛋白。篩選到經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序確認(rèn)的正確重組表達(dá)質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE觀察到約80kD的重組蛋白表達(dá)，主要出現(xiàn)在細(xì)菌包涵體中。經(jīng)過(guò)8M尿素變性增溶和稀釋復(fù)性后，再通

8、過(guò)陰離子交換柱及GST蛋白純化柱分離純化后我們得到了純度約為90％的GST-Hsp70L1融合蛋白。 Hsp70L1蛋白與HSP70蛋白家族的其他蛋白具備高同源性，這揭示了Hsp70L1蛋白可能與其他HSP70蛋白在DC細(xì)胞膜上享有共同的受體。故我們采用Western-blot方法檢測(cè)GST pull-down洗脫下的蛋白與CD40，CCR5，LOX-1及TLR2/4這些已知的HSP蛋白受體的抗體結(jié)合情況。結(jié)果顯示GST-Hsp

9、70L1融合蛋白-磁珠組中檢測(cè)出TLR2、TLR4及LOX-1這三種受體蛋白，而GST蛋白與磁珠結(jié)合組及空白磁珠組這兩對(duì)照組均未見(jiàn)這三種受體，說(shuō)明Hsp70L1蛋白能夠特異與這三種受體結(jié)合，提示TLR2、TLR4及LOX-1都可能是HSP70L1的受體。 第二部分：DC表面HSP70家族相關(guān)受體的克隆及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立及與Hsp70L1蛋白結(jié)合檢測(cè) 在GST Pull-Down體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們采用克隆受

10、體表達(dá)這一策略，研究這些HSP家族相關(guān)受體與Hsp70L1蛋白在細(xì)胞表面的結(jié)合情況。 抽提FHP-1細(xì)胞的總RNA，通過(guò)RT-PCR．克隆出人CD40，CCR5和LOX-1分子，連接至測(cè)序載體p-GEMT上，經(jīng)過(guò)測(cè)序核實(shí)后用內(nèi)切酶切下目的分子，將其分別連接到真核表達(dá)載體pCDNA3.1/myc-His(-)B上。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lip2000將這些重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)G418篩選4周以上得到穩(wěn)定表達(dá)這些受體

11、的細(xì)胞株。 在此基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡直接檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞與FITC標(biāo)記的Hsp70L1蛋白與其的結(jié)合情況。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，與對(duì)照的293細(xì)胞相比，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Hsp70L1蛋白能明顯與穩(wěn)定表達(dá)CD40和TLR4的293細(xì)胞結(jié)合；激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Hsp70L1蛋白都結(jié)合在穩(wěn)定表達(dá)TLR4的293細(xì)胞表面，而對(duì)照293細(xì)胞則未能觀察到此現(xiàn)象。這也驗(yàn)證了TLR4受體在GST Pull-D

12、own體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD40可能也是Hsp70L1蛋白的受體。 第三部分：Hsp70L1蛋白與TLR4受體作用的功能研究 根據(jù)前一部分和第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們重點(diǎn)選擇了TLR4這個(gè)受體，研究并探求其與Hsp70L1蛋白與TLR4結(jié)合后引起的生物學(xué)功能，確定其相互作用的生理意義和影響，為Hsp70L1的免疫佐劑效應(yīng)提供基礎(chǔ)原理。 結(jié)果表明，C57BL/6 TLR4缺陷小鼠骨髓來(lái)源的DC與Hsp70L

13、1蛋白作用后，其表面成熟標(biāo)志分子CD40、CD80和I-ab的表達(dá)水平無(wú)明顯改變，明顯低于HSP70L1蛋白刺激的正常小鼠DC，而HSP70L1刺激的正常小鼠DC，其CD40、CD80的表達(dá)明顯增高；HSP70L1刺激的TLR4缺陷小鼠DC誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β表達(dá)無(wú)明顯改變，明顯低于正常小鼠，而HSP70L1刺激的正常小鼠DCTNF-α和IL-1β表達(dá)明顯增高；在誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答方面，HSP70L1不能誘導(dǎo)TLR

14、4缺陷組小鼠的脾細(xì)胞CEA特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)，而可以在正常小鼠DC組誘導(dǎo)小鼠的脾細(xì)胞CEA特異性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。而且HSP70L1具有高效免疫佐劑效應(yīng)，在人體外體外致敏人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的DC后體外誘導(dǎo)特異性的T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用人TLR4抑制劑可以明顯抑制HSP70L1介導(dǎo)的CEA抗原負(fù)載的人DC誘導(dǎo)特異T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。 Hsp70L1刺激293-TLR4細(xì)胞后信號(hào)通路活化研究結(jié)果顯示：Hsp70L1與TLR4作

15、用后能引起細(xì)胞內(nèi)IκB-α的磷酸化和NF-κB的活化，同時(shí)激活JNK和P38，ERK和IKKMAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。進(jìn)一步闡明了Hsp70L1與TLR4作用的分子機(jī)制。 以上結(jié)果表明：Hsp70L1蛋白通過(guò)TLR4介導(dǎo)促進(jìn)DC細(xì)胞成熟表型改變與誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)以及DC向T細(xì)胞遞呈抗原，誘導(dǎo)特異性的T細(xì)胞應(yīng)答，從而確證了TLR4是Hsp70L1蛋白的受體。通過(guò)研究TLR4與Hsp70L1蛋白作用后促進(jìn)DC功能的研究，為如何提

16、高Hsp70L1蛋白的免疫佐劑功能的及Hsp70L1蛋白在免疫治療上的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。 結(jié)論： 1．構(gòu)建了pGEX-4T-2-Hsp70L1重組質(zhì)粒，通過(guò)Source15Q離子交換柱和GSTrapTMFF柱純化了GST-Hsp70L1融合蛋白。GST-Hsp70L1蛋白與膜蛋白經(jīng)過(guò)GST Pull-Down作用后結(jié)果顯示，在體外條件下與TLR2、TLR4及Lox-1能夠和GST-Hsp70L1蛋白結(jié)合；

17、 2．克隆了CD40、CCR5和Lox-1的cDNA連接至真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1/myc-His(-)B中，建立和篩選了穩(wěn)定表達(dá)CD40、CCR5和Lox-1的HEK293細(xì)胞，通過(guò)FITC標(biāo)記的Hsp70L1蛋白與穩(wěn)定表達(dá)受體細(xì)胞的作用，證明hsp70L1能夠與穩(wěn)定表達(dá)TLR4、CD40的HEK293細(xì)胞結(jié)合，而不與對(duì)照HEK293細(xì)胞結(jié)合。 3．證明了TLR4是Hsp70L1誘導(dǎo)DC表型成熟和炎性因子表達(dá)以及誘導(dǎo)特異性

18、的T細(xì)胞應(yīng)答的功能受體之一。Hsp70L1能夠促進(jìn)DC表面CD40，CD80的表達(dá)和促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-β的分泌，而且CEA576-669-Hsp70L1融合蛋白致敏DC誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞是由TLR4介導(dǎo)的Hsp70L1與DC相互作用引起的。 4．HSP70L1與TLR4的信號(hào)通路研究表明：Hsp70L1與TLR4作用后能引起細(xì)胞內(nèi)IκB-α的磷酸化和NF-κB的活化，同時(shí)磷酸化JNK和P38，ERK和IKK來(lái)活化