(AABB)型-α螺旋短肽的從頭設(shè)計及其抗菌抗腫瘤機制研究.pdf

1、近年來,細(xì)菌及腫瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)藥物的抗性問題越來越嚴(yán)重,人們亟待尋找一些作用機制不同而且高效低毒的新型藥物。抗菌肽是一類存在于幾乎所有生物體內(nèi)的先天免疫效應(yīng)分子,呈現(xiàn)廣譜的抗菌抗腫瘤活性,具有很好的藥物開發(fā)潛能。其中具有兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽分子,在自然界中分布尤為廣泛,由于這類抗菌肽分子長度較短,易于人工合成,所以常被作為多肽結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究的模式分子。
　　 本研究依據(jù)天然抗菌肽序列特征以及α-螺旋折疊理論,人工設(shè)計了一系

2、列具有不同抗菌抗腫瘤活性的兩親螺旋短肽分子(長度≤18AA)。這些多肽中除G(IIKK)I-NH2和G(VVKK)3V-NH2外,其它多肽與天然螺旋抗菌肽類似,在進(jìn)入疏水環(huán)境或接觸負(fù)電性磷脂囊泡后,均可以發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變形成兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)。我們還通過修改氨基酸序列考察了不同結(jié)構(gòu)因素對螺旋多肽生物活性的影響。通過活性檢測選取選擇性最好的肽序列G(IIKK)3I-NH2來進(jìn)一步研究它的抗菌抗腫瘤機制。論文還利用共培養(yǎng)體系證實了該多肽對細(xì)

3、菌和腫瘤細(xì)胞的選擇性。以上這些研究可以為今后更好的人工設(shè)計活性螺旋短肽分子提供實驗基礎(chǔ)和理論參考。逐漸增加G(IIKK)nI-NH2分子中序列單元的重復(fù)次數(shù)n(1-4),多肽抗菌抗腫瘤活性以及對正常細(xì)胞的毒性都會隨之增強。其中只有G(IIKK)31-NH2具有高效低毒的特點。通過分析得出n≤3時,增加多肽重復(fù)單元的數(shù)目,可以保證多肽對正常細(xì)胞低毒的同時明顯提高多肽的抗菌抗腫瘤活性,當(dāng)n>3后,對多肽抗菌抗腫瘤活性的影響變小,但對正常細(xì)胞

4、的毒性會隨n的增加顯著的增強。
　　 本文通過研究多肽兩親螺旋結(jié)構(gòu)中親/疏水面分離程度以及親/疏水面交叉位置不同對多肽活性的影響發(fā)現(xiàn),親/疏水面完全分離的多肽分子對正常細(xì)胞的毒性明顯增大,在疏水面插入一個Lys分子后可明顯降低多肽對正常細(xì)胞的毒性而不影響多肽分子的抗菌抗腫瘤活性。我們還發(fā)現(xiàn)親水氨基酸在疏水面的插入位置不同對多肽的活性影響并不明顯。除此實驗結(jié)果還證實當(dāng)疏水面具有連續(xù)4個疏水氨基酸時,就可以滿足螺旋多肽與磷脂膜疏水核

5、心之間所需的疏水作用力。改變疏水氨基酸側(cè)鏈構(gòu)型后,抗菌肽對正常細(xì)胞的毒性明顯改變。Leu、Nle與Ile相比,前兩種氨基酸的疏水性以及形成螺旋的能力都有所增強。保持多肽長度以及陽離子性不變時,多肽疏水性的增加對多肽與中性磷脂膜作用的影響要大于對多肽與負(fù)電磷脂膜作用的影響?？s短疏水氨基酸側(cè)鏈長度后,分子疏水性明顯降低,多肽的各項生物活性都明顯降低,這也說明多肽疏水面保證一定的疏水性對多肽的活性也是必須的。通過考察親水面氨基酸側(cè)鏈長度對多肽

6、活性的影響發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi)縮短親水氨基酸的側(cè)鏈長度,可以明顯提高多肽抗菌抗腫瘤活性以及對正常細(xì)胞的毒性,當(dāng)縮短到一定程度后(一個-CH2-),多肽在低濃度時的活性降低,高濃度時活性增加,這可能是親水氨基酸側(cè)鏈太短時,會對疏水面與磷脂膜疏水核心的相互作用產(chǎn)生影響。研究中我們還發(fā)現(xiàn),多肽分子的溶血活性與多肽分子的表面活性存在明顯的正相關(guān)特性。這可能是由于螺旋多肽向紅細(xì)胞膜表面吸附時,不存在足夠的靜電作用,所以表面活性強的螺旋多肽向中性磷脂

7、膜表面吸附的能力越強,導(dǎo)致溶血毒性增強。比較所有的多肽分子,只有G(IIKK)3I-NH2分子具有高效抗菌抗腫瘤活性時對正常細(xì)胞的毒性較低,即該多肽具有很高的選擇性。我們利用體外共培養(yǎng)體系也證實了這種選擇性的存在。同時我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)所有多肽分子對革蘭氏陽性菌的作用要強于革蘭氏陰性菌,這種對細(xì)菌種類的選擇性與不同細(xì)菌在細(xì)胞膜組成的差異有關(guān)。通過對多肽G(IIKK)3I-NH2的抗菌抗腫瘤機制研究發(fā)現(xiàn),該多肽也可以像多數(shù)天然抗菌肽一樣破