牛源犬新孢子蟲對孕鼠胎盤的損傷作用研究.pdf

1、犬新孢子蟲（Neospora caninum）是寄生于牛、羊、犬等多種哺乳動物細胞內(nèi)的一種原蟲。犬新孢子蟲主要引起母畜流產(chǎn)、死胎或新生兒運動障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。新孢子蟲病可垂直傳播，對牛的危害極為嚴(yán)重，已成為危害養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。但犬新孢子蟲對胎盤的損傷及其機制目前尚不清楚。為確定牛源犬新孢子蟲對胎盤的損傷作用，本研究以BALB/c小鼠為實驗動物，在建立牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型的基礎(chǔ)上，對孕鼠胎盤組織細胞進行病理學(xué)損傷觀察

2、，孕鼠胎盤相關(guān)細胞因子檢測，孕鼠胎盤細胞凋亡相關(guān)蛋白檢測，以及影響孕鼠胎盤物質(zhì)轉(zhuǎn)運、胎盤血流和胎兒生長發(fā)育等各項胎盤激素指標(biāo)檢測，以此闡明牛源犬新孢子蟲感染對胎盤組織細胞的損傷作用，以期為犬新孢子蟲致病作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　1、牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型的建立
　　本試驗以雌性BALB/c小鼠為實驗動物，分離Vero細胞中犬新孢子蟲速殖子，分不同劑量組腹腔接種雌性BALB/c小鼠，第二天與雄性BALB/c小鼠合籠，每天觀

3、察小鼠臨床癥狀和發(fā)病情況。應(yīng)用檢測犬新孢子蟲Nc5基因的PCR方法在攻蟲后第12 d即可以在胎盤中檢測到蟲體DNA，成功建立了牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型，確定了每個模型小鼠的攻蟲劑量為105個蟲體。
　　2、牛源犬新孢子蟲對孕鼠胎盤組織細胞的損傷觀察
　　本試驗以牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型為研究對象，測定了胎盤重量和胎盤系數(shù)，病理學(xué)觀察孕鼠胎盤組織細胞損傷變化，流式細胞術(shù)檢測胎盤滋養(yǎng)層細胞凋亡情況。結(jié)果表明，模型組孕鼠隨攻蟲

4、天數(shù)的增加，體重降低，伴有流產(chǎn)現(xiàn)象，總胎數(shù)和活胎數(shù)均有不同程度的減少，多成為死胎或吸收胎；與對照組比較，胎盤重量和胎盤系數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)意義；病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加，胎盤的損傷程度逐漸加大；胎盤細胞凋亡數(shù)量也隨著攻蟲時間的延長而增加。說明牛源犬新孢子蟲感染對孕鼠胎盤具有一定的病理性損傷，主要對胎盤滋養(yǎng)細胞的損害，影響胎盤的物質(zhì)轉(zhuǎn)運和激素的合成，致使胎兒生長發(fā)育遲緩、死產(chǎn)、流產(chǎn)等現(xiàn)象的發(fā)生。
　　3、牛源犬新孢子蟲感

5、染孕鼠胎盤相關(guān)細胞因子檢測
　　本試驗以建立的牛源犬新孢子蟲孕鼠感染模型為研究對象，檢測孕鼠胎盤細胞懸液中IFN-γ、IL-4及TGF-β含量。結(jié)果表明，在孕鼠胎盤細胞懸液的檢測中，模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加IFN-γ和IL-4濃度均有不同程度的波動，但整體傾向于不利胎兒生長發(fā)育的方向發(fā)展。尤其模型組孕鼠TGF-β濃度隨攻蟲天數(shù)的增加逐步上調(diào)，已嚴(yán)重影響胎兒的正常生長發(fā)育。
　　4、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤細胞凋亡相關(guān)蛋白

6、檢測
　　本試驗以牛源犬新孢子蟲感染孕鼠模型為實驗動物，應(yīng)用免疫組化法檢測孕鼠胎盤組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及TNF-α表達情況。結(jié)果表明，Bax、TNF-α的表達上調(diào)和Bcl-2表達量下調(diào)，可能啟動內(nèi)、外源性的細胞凋亡途徑，使胎盤細胞凋亡增加，致使胎盤缺氧、缺血，導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)。
　　5、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤激素檢測
　　本試驗采用ELISA法檢測牛源犬新孢子蟲感染后孕鼠血清中CRH、ACH、

7、CG、PL及E3等激素含量變化，以此確定牛源犬新孢子蟲感染后對孕鼠胎盤功能和胎兒生長發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，牛源犬新孢子蟲感染孕鼠在妊娠中期血清中CRH、ACH、CG、PL及E3等胎盤激素含量均有顯著下調(diào)現(xiàn)象，而且在整個妊娠過程中模型組孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加與對照組比較，5種胎盤激素均出現(xiàn)了顯著性波動變化，這種相互作用、相互影響的變化是牛源犬新孢子蟲感染所致孕鼠胎盤組織病理損傷和滋養(yǎng)層細胞凋亡增加的病理生理基礎(chǔ)。而這些激素含量顯著變化的結(jié)果

8、必然導(dǎo)致不良妊娠現(xiàn)象的發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　1、本試驗成功建立了牛源犬新孢子蟲感染 BALB/c孕鼠模型，確定了每個模型小鼠的攻蟲劑量為105個蟲體。
　　2、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠的胎盤重量和胎盤系數(shù)與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)牛源犬新孢子蟲感染對孕鼠胎盤具有一定的病理性損傷，胎盤滋養(yǎng)細胞破壞，影響胎盤對胚胎所需營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和胎盤激素的合成。
　　3、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠隨攻蟲天數(shù)的增加，孕

9、鼠胎盤細胞懸液中IFN-γ、IL-4及TGF-β濃度整體傾向于不利胎兒生長發(fā)育的方向發(fā)展。
　　4、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠胎盤組織中Bax、TNF-α的表達上調(diào)和Bcl-2表達量下調(diào)，可能啟動內(nèi)、外源性的細胞凋亡途徑，使胎盤細胞凋亡增加，致使胎盤缺氧、缺血，導(dǎo)致胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)。
　　5、牛源犬新孢子蟲感染孕鼠在妊娠中期血清中CRH、ACH、CG、PL及E3等激素含量的顯著下調(diào)，是牛源犬新孢子蟲感染所致孕鼠胎盤組織損傷和細胞凋