新孢子蟲NcSRS2 DNA疫苗的研究.pdf

1、新孢子蟲(Neosporacaninum)是引起犬運動神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種頂復(fù)合體寄生原蟲，并且是世界范圍內(nèi)造成奶牛流產(chǎn)的主要原因。目前，還沒有防治新孢子蟲病的有效措施。一般認(rèn)為疫苗免疫是預(yù)防奶牛流產(chǎn)和降低經(jīng)濟(jì)損失的可行性措施。為此，本文進(jìn)行了新孢子蟲NcSRS2DNA疫苗的研究。　　根據(jù)新孢子蟲NcSRS2基因序列，設(shè)計了一對含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位點的引物。以含有NcSRS2基因的質(zhì)粒P43為模板，利用聚合酶鏈反

2、應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得NcSRS2ORF基因片段，用PstⅠ和XbaⅠ雙酶切該片段，回收得到含有以上兩個酶切位點粘端的NcSRS2ORF基因，將此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，獲得重組質(zhì)粒PcNCSRS2。經(jīng)PCR鑒定、限制性內(nèi)切酶分析和克隆片段序列測定、比較，證實了重組質(zhì)粒的正確性?！　〖兓療o內(nèi)毒素的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcNcSRS2，脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞Vero。RT-PCR和weste

3、rn-blot方法鑒定目的基因在Vero細(xì)胞中的表達(dá)。RT-PCR和western-blot證實，先前構(gòu)建的犬新孢子蟲NcSRS2基因的真核表達(dá)載體能夠在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)NcSRS2抗原，為新孢子蟲NcSRS2基因DNA疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)?！　》謩e用生理鹽水、空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、重組質(zhì)粒pcNcSRS2、福氏完全佐劑和pcNcSRS2的混合物免疫BALB/c小鼠。ELISA、LPA、Griess試劑和半定量RT-PCR檢