HBx基因缺失突變體(HBx-d382)對L02細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機制探討.pdf

1、目的：原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是來源于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，是世界上最常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究表明慢性乙型肝炎病毒感染和原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，幾乎所有HBV(hepatitis B virus)相關(guān)的肝癌組織中可以檢測到基因組整合的HBV DNA。在眾多病毒基因組整合亞單位中HBx(Hepatitis B virus X gene)基因可以轉(zhuǎn)錄并翻譯成相應(yīng)HBx蛋白，其與肝癌

2、的關(guān)系被廣泛研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織的基因組中廣泛存在HBx基因的整合和突變，并篩選出2個缺失突變體HBx-d382(HBx基因nt382-400缺失突變)和HBx-d431，其中HBx-d382在肝癌組織中檢出率較高，我們猜想HBx-d382可能與肝細(xì)胞癌密切相關(guān)，隨后我們成功構(gòu)建了HBx-d382真核表達(dá)載體pcDNA3.0/HBx—d382。本研究將建立穩(wěn)定表達(dá)HBx基因缺失突變體(HBx—d382)的L02肝細(xì)胞株L02

3、/HBx-d382，探討HBx-d382對L02細(xì)胞增殖，G1期細(xì)胞周期調(diào)控及microRNA表達(dá)譜的影響。
　　 方法：含HBx-d382的重組質(zhì)粒(pcDNA3.O/HBx-d382)經(jīng)過PCR(Polymerasechain reaction)擴(kuò)增、雙酶切及DNA測序鑒定后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)HBx-d382的L02肝細(xì)胞株，PCR鑒定L02細(xì)胞基因組中HBx-d382基因整合，RT-PCR(Reve

4、rse transcription polymerase chain reaction)和western blot鑒定其表達(dá)。通過MTT法，軟瓊脂克隆形成實驗檢測HBx-d382對L02細(xì)胞增殖及非錨定依賴生長能力的影響，用流式細(xì)胞儀檢測其對細(xì)胞周期的影響；通過real-time定量PCR及western-blot鑒定轉(zhuǎn)染HBx—d382后L02細(xì)胞cyclin D1，cylinG1，E2F1表達(dá)改變；通過microRNA芯片技術(shù)檢測H

5、Bx-d382對L02細(xì)胞miRNA(microRNA)表達(dá)譜的影響。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定HBx-d382重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒的L02細(xì)胞基因組存在HBx-d382整合，RT-PCR及Westem-blot表明在RNA水平和蛋白水平存在HBx-d382表達(dá)。(3)MTT及軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明穩(wěn)定表達(dá)HBx-d382的L02細(xì)胞其增殖能力和非錨定生長能力增強，細(xì)胞周期檢測證實轉(zhuǎn)染HB

6、x-d382的L02細(xì)胞S+G2期細(xì)胞比例升高。(4)real-time定量PCR結(jié)果表明與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.0的L02細(xì)胞(L02/pcDNA3.0)相比L02/HBx-d382細(xì)胞cyclin D1，cylin G1，E2F1的mRNA表達(dá)明顯增強(P<0.05)；western-blot結(jié)果證實與102/pcDNA3.0細(xì)胞相比L02/HBx-d382細(xì)胞cyclin D1，cylin G1，E2F1蛋白表達(dá)明顯增強(p<0

7、.05)(5)microRNA芯片發(fā)現(xiàn)與L02/pcDNA3.0組細(xì)胞相比L02/HBx-d382組細(xì)胞mir-1，mir-338—3p，mir-551b，miR-455-3p，miR-200c表達(dá)下調(diào)，miR-501，miR-595，miR-1307，miR-1180，miR-497，miR-1246，miR-623表達(dá)上調(diào)。
　　 結(jié)論：本研究成功的構(gòu)建了HBx基因缺失突變體(HBx-d382)的真核表達(dá)模型，證實HBx-d