桑樹雌花形成中乙烯作用機(jī)制的研究.pdf

1、花性調(diào)控的研究一直以來是生物學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)，果桑，葉用桑，生態(tài)桑等不同用途品種的開發(fā)對(duì)桑樹花性別要求不同。桑樹種質(zhì)資源研究的傳統(tǒng)方法為通過雜交育種篩選出優(yōu)良性狀，然后通過無(wú)性繁殖（扦插或嫁接）的方式增加群體數(shù)量。雜交育種存在周期長(zhǎng)，效率低的缺點(diǎn)，對(duì)于不同需求品種的開發(fā)，如果能通過分子學(xué)手段在植株生長(zhǎng)早期鑒定到其性別，將縮短育種周期，避免育種與生產(chǎn)中的浪費(fèi)。因此，對(duì)桑樹花性調(diào)控的研究具有極大地理論價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　乙烯是一種重要

2、的氣體植物激素，參與調(diào)節(jié)多種植物生長(zhǎng)、發(fā)育過程，并能響應(yīng)多種外部信號(hào)，如種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老、花性分化和抵抗生物與非生物脅迫等。乙烯作為植物的性別激素調(diào)控花器官性別分化，黃瓜的兩個(gè)性別決定基因（F、M）經(jīng)鑒定為乙烯合成的限速酶ACS家族的基因。
　　桑樹花性分雌花、雄花、雌雄同花、雌雄同穗等，根據(jù)每株樹開花的不同又分為雌雄同株，雌雄異株。桑樹花性的主要決定因素是遺傳因子。另外桑樹花性也受到激素、環(huán)境等因素的影響。

3、偏雄性的植株在噴施乙烯利后，出現(xiàn)了更多的雌花，而使雄花減少。赤霉素與乙烯利作用相反。構(gòu)建桑樹花芽性別分化時(shí)期的基因連續(xù)表達(dá)譜，將有助于研究乙烯與雌花發(fā)育的關(guān)系，并為篩選性別決定基因，構(gòu)建同基因型雌雄異株育種材料等提供豐富的研究數(shù)據(jù)，加快桑樹育種速度。
　　本研究首先通過生物信息學(xué)的方法鑒定了桑樹中乙烯合成與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因，結(jié)合多種軟件分析了其基因結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。進(jìn)一步檢測(cè)其在六個(gè)不同組織（根、皮、葉、雄花、雌花

4、、果）中的表達(dá)模式。我們還鑒定了響應(yīng)乙烯信號(hào)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的基因，分析了其序列信息及在多種組織中的表達(dá)情況。隨后我們選取了開雌花的珍珠白作為實(shí)驗(yàn)材料，用石蠟切片的方法確定了其花芽發(fā)育時(shí)期形態(tài)變化，從中選擇包括花性分化時(shí)期的6個(gè)樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了差異基因分析，KEGG功能富集分析，聚類分析，并重點(diǎn)選取激素相關(guān)基因、AP2/ERF家族基因和MADS-box家族基因進(jìn)行了表達(dá)分析，隨后選取特異表達(dá)基因進(jìn)行了共表

5、達(dá)分析。通過原位雜交的方法研究了乙烯合成關(guān)鍵基因在花芽中的表達(dá)位置。通過乙烯利（分解生成乙烯）和AVG（抑制乙烯的合成）兩種藥物處理珍珠白花芽檢測(cè)了AP2/ERF家族基因表達(dá)的變化。最后構(gòu)建了4個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)基因過表達(dá)載體，在煙草中驗(yàn)證其功能。本研究所獲得研究結(jié)果如下：
　　1、桑樹乙烯合成與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因鑒定及生物信息學(xué)分析
　　結(jié)合使用blast與HMM search兩種方法在川?；蚪M中共鑒定到29個(gè)乙烯合成與信

6、號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因及116個(gè) AP2/ERF家族基因。基因位置顯示 MnEIN3、MnEIL1和MnEIL4、MnEIL5分別都定位在桑樹基因組的同一個(gè)scaffold上。對(duì)四個(gè)較重要家族（ACS、ACO、ETR、EIN3）的基因進(jìn)行了克隆驗(yàn)證?；蚪Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示桑樹中這四個(gè)基因家族，除了MnEIL4外，其他基因與以往研究的同源基因具有一致的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域分析顯示MnACS5由于C末端缺失，缺乏相應(yīng)的磷酸化位點(diǎn)，其他MnACS家族基因都含有

7、保守的功能基序。MnACO家族基因都含有保守的功能基序。ETR家族中MnEIN4在N端含有一個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，MnERS1蛋白C末端相對(duì)其他成員較短，導(dǎo)致其缺失一個(gè)信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域。MnEIN3家族中，除保守的結(jié)構(gòu)域外，MnEIN3和MnEIL1還含有在綠豆基因中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)保守的富含谷氨酸和天冬氨酸的區(qū)域。檢測(cè)這四個(gè)基因家族在六個(gè)桑樹組織（根、皮、葉、雄花、雌花、果）中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)模式多樣，同時(shí)有一些組織特異表達(dá)的基因，其中MnACS

8、5在雌花中特異表達(dá)。MnACO1和MnACO2在果實(shí)中特異表達(dá)。MnEIN3和MnEIL1在根和果中顯示更高的表達(dá)。
　　AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)乙烯信號(hào)，按結(jié)構(gòu)分為5個(gè)亞家族。各亞家族基因數(shù)目為ERF(58)、DREB(33)、AP2(21)、RAV(3)、Soloist(1)。按系統(tǒng)發(fā)生樹分析又分為15個(gè)群。DREB亞家族包括（I-IV）群，ERF亞家族包括（V-X）群。其中V群基因中，桑樹有11個(gè)成員，而擬南芥中僅含有5個(gè)

9、成員。檢測(cè)含有EAR（DLNXXP、LXLXL、LDLNLXPP）基序的基因顯示，含 LXLXL基序的基因數(shù)目最多，另外MnERF亞家族含EAR基序的基因主要集中在MnERF-B1亞群。基因表達(dá)模式表明其有不同的表達(dá)模式。其中MnERF-B3-21在雄花中特異表達(dá)，MnDERB-A4-7在葉中更豐富，MnAP2-5在雄花中有高水平表達(dá)，另外有9個(gè)基因在任何組織中都沒有檢測(cè)到表達(dá)，推測(cè)這些基因響應(yīng)某種特殊的外界刺激或內(nèi)部環(huán)境信號(hào)。

10、　　2、桑樹早期花芽發(fā)育形態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄組分析
　　選取僅開雌花的珍珠白做為實(shí)驗(yàn)材料，通過石蠟切片技術(shù)觀察其花芽發(fā)育時(shí)期的形態(tài)變化，選取其中包括花性分化時(shí)期的6個(gè)花芽樣本（flwoer bud，F(xiàn)B）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別命名為 FB1-FB6。測(cè)序結(jié)果顯示共得到118584個(gè)contigs與87719個(gè)unigenes。其中unigenes的平均長(zhǎng)度為727 bp，中間長(zhǎng)度為381 bp，最大長(zhǎng)度為16738 bp，N50和N90分

11、別為1307 bp和282 bp。功能注釋結(jié)果顯示有45.44％的基因可以至少在一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，其中在 Nr庫(kù)中得到注釋的基因最多（39.64%），僅有6.78%的基因在所有數(shù)據(jù)庫(kù)中都能得到注釋。通過blast和estscan分別得到35536（40.5%）條和26726（30.4%）條可編碼蛋白質(zhì)的序列。我們采取兩種方式尋找差異基因。第一種為相鄰時(shí)間點(diǎn)間差異表達(dá)基因，數(shù)目為808個(gè)。第二種為其他時(shí)間點(diǎn)與FB1之間差異表達(dá)基因，數(shù)

12、目為1037個(gè)。所有差異基因一起聚類分析顯示大多數(shù)差異基因在FB2和FB3上調(diào)，隨后被下調(diào)表達(dá)。
　　差異基因KEGG富集分析顯示FB1與FB2之間的差異基因顯著富集在植物激素信號(hào)途徑、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)、α-亞麻酸代謝、磷酸肌醇代謝和類黃酮合成五個(gè)途徑。而在FB3和FB4之間的差異基因同樣富集在除類黃酮合成之外的四個(gè)途徑。植物激素信號(hào)途徑KEGG通路顯示，在FB1與FB2之間的差異基因中，乙烯信號(hào)途徑的EBF1/2基因發(fā)生了下調(diào)

13、表達(dá)，暗示了EIN3轉(zhuǎn)錄本可能得到積累并激活了下游的響應(yīng)因子。
　　激素相關(guān)基因表達(dá)分析顯示乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達(dá)迅速升高，而生長(zhǎng)素中部分基因也在這個(gè)時(shí)間段高表達(dá)。油菜素內(nèi)脂基因主要在 FB2和FB3時(shí)期表達(dá)，赤霉素基因主要在FB4-FB6表達(dá)較高，脫落酸基因主要在FB6表達(dá)較高。
　　AP2/ERF家族基因表達(dá)模式多樣，其中有一部分僅在FB2和FB3表達(dá)較高。而在MADS-box家族中有接近一半基因的F

14、PKM是隨時(shí)間逐漸增加的。我們分別以這兩類基因作為特征表達(dá)模式，與所有在任一樣本中FPKM>5的基因進(jìn)行共表達(dá)分析，鑒定到具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)的兩群基因（P19對(duì)應(yīng)AP2/ERF，P24對(duì)應(yīng)MADS-box）。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖顯示 P19中200多個(gè)基因之間顯示強(qiáng)關(guān)聯(lián)度，P24網(wǎng)絡(luò)圖顯示了相對(duì)松散的結(jié)構(gòu)，其中具有40個(gè)以上鏈接的基因僅有一個(gè)，20-40個(gè)鏈接的基因有2個(gè)，10-20個(gè)鏈接的基因有10個(gè)。
　　3、珍珠白MaACS2與4個(gè)AP2/E

15、RF基因功能分析
　　MaACS2原位雜交結(jié)果表明其主要在花序的外圍表達(dá)，切片形態(tài)數(shù)據(jù)顯示在這個(gè)階段花芽中花器官開始分化，這些結(jié)果暗示桑樹花芽性別分化過程中乙烯合成量增加，推測(cè)單性花形成屬于第一種花性別分化模型，即在花器官發(fā)育早期形成兩性起始原基，隨后雌花中的雄蕊原基發(fā)育受到抑制，這個(gè)過程可能是乙烯在花器官分化早期大量形成的結(jié)果。TENUL檢測(cè)顯示在花萼內(nèi)側(cè)有顯著的綠色熒光信號(hào)，暗示乙烯通過導(dǎo)致細(xì)胞凋亡抑制雄蕊的發(fā)育。
　　

16、采用AVG與乙烯利處理FB2時(shí)期的花芽，隨后檢測(cè)有關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示乙烯利處理后MaDREB-A1亞群在第7天表達(dá)顯著升高；而AVG處理后，相關(guān)基因表達(dá)與以往研究不一致。在煙草中異源表達(dá)AP2/ERF基因?qū)е聼煵莼òl(fā)育異常，花瓣發(fā)育不全，雌蕊突出，雄蕊數(shù)量減少且部分雄蕊發(fā)育異常。
　　本研究通過生物信息學(xué)的方法在川?；蛑需b定到29個(gè)乙烯合成與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因，序列分析表明，其在序列結(jié)構(gòu)，保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化等方面與其他物種具

17、有較高的保守性，暗示其可能發(fā)揮同樣的功能。珍珠白花芽早期發(fā)育形態(tài)變化及轉(zhuǎn)錄組分析，顯示在花芽中花器官分化時(shí)期有大量基因表達(dá)變化劇烈。乙烯合成限速酶基因MaACS2在FB2表達(dá)顯著增加，生長(zhǎng)素協(xié)同乙烯一起發(fā)揮作用，暗示乙烯在雌花發(fā)育中發(fā)揮一定的作用。MaACS2原位雜交結(jié)果顯示其表達(dá)在花序的外圍。TENUL檢測(cè)顯示花萼內(nèi)側(cè)存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，轉(zhuǎn)基因煙草花發(fā)育異常，這些結(jié)果暗示珍珠白雌花發(fā)育過程中，乙烯可能通過引起細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制雄蕊，促進(jìn)雌