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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
膿毒癥是感染所致的嚴(yán)重威脅生命的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。膿毒癥常繼發(fā)于創(chuàng)傷、大手術(shù)等重大應(yīng)激事件,可發(fā)生于各個(gè)年齡段的患者。膿毒癥發(fā)生率、病死率高,幸存者也常因?yàn)椴l(fā)癥和后遺癥而導(dǎo)致生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。腸屏障的破壞一直以來被認(rèn)為是引發(fā)膿毒癥感染和多器官功能障礙綜合征(MODS)的始動(dòng)因素之一。腸屏障的構(gòu)成錯(cuò)綜復(fù)雜,是人體免疫系統(tǒng)的重要組成部分,因此日益成為膿毒癥研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。氫氣是大氣層中自然存在的氣體,人體
2、中也有微量的氫以分子形式存在。文獻(xiàn)報(bào)道,一定濃度的氫氣對(duì)多種疾病有治療作用,并已經(jīng)通過許多模型證實(shí)。氫氣治療的具體機(jī)制目前還不十分明確。Rho激酶(ROCK)是一種絲/蘇氨酸激酶,廣泛存在于哺乳動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi),參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)。本研究旨在探究氫氣對(duì)膿毒癥離體人腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響,以及Rho激酶是否參與了氫氣的作用機(jī)制。
方法:
人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2,培養(yǎng)于無菌含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,傳代
3、培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)研究。
第一部分:用 Transwell小室建立 Caco-2單層細(xì)胞屏障模型,或?qū)⒓?xì)胞接種到96孔板或6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為6組:對(duì)照組(C組)、0.1mg/L細(xì)菌脂多糖(LPS)處理組(L1組)、1mg/L LPS處理組(L2組)、10mg/L LPS處理組(L3組)、50mg/L LPS處理組(L4組)、100mg/L LPS處理組(L5組)。處理24h后通過檢測(cè)跨上皮電阻值(TEER)和FITC-右旋糖
4、酐通過率來觀察Caco-2單層細(xì)胞屏障完整性和通透性的改變,MTT法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,Western Blot法檢測(cè)處理24h后腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白 ZO-1的表達(dá)水平。根據(jù)結(jié)果選擇能滿足實(shí)驗(yàn)需要的LPS處理濃度。
第二部分:同第一部分建立細(xì)胞模型,實(shí)驗(yàn)分為5組:對(duì)照組(C組)、富氫培養(yǎng)基組(H組)、細(xì)菌脂多糖(LPS)處理組(L組)、富氫培養(yǎng)基+LPS處理組(HL組)、ROCK抑制劑(Y-27632)+LPS處理組(YL
5、組)。對(duì)照組與富氫培養(yǎng)基組分別加入等容量DMEM空白高糖培養(yǎng)基和0.6mmol/L富氫培養(yǎng)基。LPS處理濃度為50mg/L,Y-27632處理濃度為25μmol/L。分別于0h、6h、12h、24h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻值(TEER)和24h FITC-右旋糖酐通過率,MTT法檢測(cè)處理24h后細(xì)胞凋亡水平,Western Blot法檢測(cè)6h、12h、24h細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1和ROCK蛋白的表達(dá)水平,實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC
6、R)技術(shù)檢測(cè)處理6h、12h、24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1 mRNA和ROCK mRNA表達(dá)水平,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)處理24h后Caco-2細(xì)胞ZO-1蛋白分布變化。
結(jié)果:
第一部分:與對(duì)照組相比,0.1mg/L LPS未能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變和 Caco-2細(xì)胞凋亡水平的顯著上升(P>0.05),也未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)(P>0.05);1m
7、g/L和10mg/L濃度的LPS能引起跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的顯著改變(P<0.05),并顯著增加Caco-2細(xì)胞凋亡(P>0.05),但未能顯著降低Caco-2細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)(P>0.05);50mg/L和100mg/L濃度的LPS既能降低跨上皮電阻值,增加FITC-右旋糖酐通過率(P<0.05),即破壞了單層細(xì)胞屏障的完整性,增加其通透性;也顯著增加了 Caco-2細(xì)胞的凋亡(P<0.05),并降低
8、了Caco-2細(xì)胞間ZO-1蛋白的表達(dá)(均P<0.05)。因此本研究選用50mg/L的LPS處理濃度。
第二部分:與對(duì)照組比較,LPS顯著降低了跨上皮電阻,增加了FITC-右旋糖酐通過率,降低了ZO-1 mRNA和蛋白表達(dá),并引起了ROCK mRNA和蛋白的過表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS引起主要分布于Caco-2細(xì)胞間的ZO-1蛋白向細(xì)胞內(nèi)聚集,而細(xì)胞膜上的ZO-1蛋白分布減少,分布的連續(xù)性被破壞。與LPS
9、處理組比較ROCK抑制劑Y-27632或富氫培養(yǎng)基的加入弱化了LPS對(duì)跨上皮電阻值和FITC-右旋糖酐通過率的影響(P<0.05);富氫培養(yǎng)基改善了LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加的情況(P<0.05),ROCK對(duì)LPS引起的Caco-2細(xì)胞凋亡增加無顯著影響(P>0.05);ROCK抑制劑或富氫培養(yǎng)基抑制了 LPS對(duì)ZO-1 mRNA和蛋白的下調(diào),降低了LPS誘導(dǎo)的ROCK mRNA和蛋白過表達(dá),并減弱了 ZO-1蛋白從 Caco
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