氫氣對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：膿毒癥是主要由感染或者高度可疑感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS），是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、重度感染和休克以及重大手術(shù)等臨床急危重癥患者常見(jiàn)的致命性并發(fā)癥，約半數(shù)以上的膿毒癥患者病情惡化可繼發(fā)組織器官損傷并進(jìn)展為重度膿毒癥和膿毒性休克，引起難以糾正的循環(huán)衰竭和多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome

2、,MODS）/多器官功能衰竭（multiple organ failure,MOF），從而導(dǎo)致臨床上一半以上膿毒癥患者死亡[1,2]。腸道既是膿毒癥病程發(fā)展過(guò)程極易受累的器官之一，也是膿毒癥病程進(jìn)展的動(dòng)力器官，腸道上皮細(xì)胞受損導(dǎo)致的腸道屏障功能障礙在SIRS-膿毒癥-MODS的連續(xù)發(fā)生發(fā)展中具有至關(guān)重要作用，因此，腸道屏障功能的保護(hù)對(duì)膿毒癥的治療和預(yù)后具有重要的臨床意義[3,4]。Rho蛋白及其主要下游效應(yīng)蛋白R(shí)ho相關(guān)螺旋卷曲蛋白激酶

3、（Rho-associated coiled-coil protein kinase,ROCK）和哺乳動(dòng)物Dia相關(guān)成蛋白1（mammalian diaphanous-related formin1,mDia1）在維持腸道上皮細(xì)胞正常細(xì)胞形態(tài)、極性和細(xì)胞間有效連接的功能穩(wěn)定狀態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[5-8]，并且在膿毒癥發(fā)展過(guò)程中，Rho蛋白信號(hào)通路參與并介導(dǎo)了腸道屏障功能的調(diào)控[9]。氫氣為近些年研究中新發(fā)現(xiàn)的一種新型醫(yī)學(xué)氣體，除了具有

4、特征性的選擇性抗氧化作用外，還具有抗炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)作用，已經(jīng)成為膿毒癥基礎(chǔ)治療研究的新靶向[10]。本課題組成員初期研究發(fā)現(xiàn)，氫氣吸入治療膿毒癥具有濃度和時(shí)間雙重依賴性，2％氫氣吸入治療可明顯提高重度膿毒癥小鼠的存活率，并減輕肺、腎和肝等重要內(nèi)臟組織的損傷[11]。本課題擬采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and puncture,CLP）制備重度膿毒癥小鼠模型，觀察氫氣吸入治療對(duì)膿毒癥腸道屏

5、障功能障礙和腸道損傷的具體保護(hù)作用并初步探討Rho-ROCK/mDia信號(hào)通路在氫氣對(duì)膿毒癥小鼠腸道組織影響中的關(guān)鍵作用，為氫氣應(yīng)用于臨床治療膿毒癥提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，為氫氣生物學(xué)效應(yīng)的深入研究開辟新的視野。
　　實(shí)驗(yàn)一：氫氣吸入對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道損傷的保護(hù)作用
　　目的：觀察氫氣吸入治療對(duì)重度膿毒癥小鼠存活率和腸道損傷的影響，并從炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等方面闡述氫氣吸入治療對(duì)膿毒癥腸道損傷的保護(hù)作用。
　　方

6、法：成年雄性ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，6~8周齡，體重20~25g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為以下四個(gè)實(shí)驗(yàn)組：假手術(shù)組、假手術(shù)+氫氣吸入組（氫氣對(duì)照組）、重度膿毒癥組（模型組）和重度膿毒癥+氫氣吸入組（氫氣治療組）。采用CLP法制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重度膿毒癥模型。氫氣吸入方案為：氫氣對(duì)照組和氫氣治療組小鼠于模型建立后1h和6h分別吸入2%氫氣1h。觀察制模后7d內(nèi)動(dòng)物的存活率。于制模后12h、24h和48

7、h時(shí)分別取回腸組織，行HE染色，觀察腸道組織病理學(xué)改變并評(píng)分，測(cè)定腸道組織中促炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、HMGB1）和抗炎性細(xì)胞因子（IL-10）的水平，測(cè)定腸道組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）和抗氧化酶（SOD、CAT）活性和氧化產(chǎn)物（MDA、8-iso-PGF2α）的水平以及細(xì)胞凋亡蛋白（active caspase3）的活性。
　　結(jié)果：1.氫氣吸入治療明顯提高重度膿毒癥小鼠7d內(nèi)的存活率。2.氫氣吸入治療明顯減輕重度膿

8、毒癥小鼠制模后不同時(shí)間點(diǎn)的腸道組織病理?yè)p傷并降低其評(píng)分。3.氫氣吸入治療明顯降低重度膿毒癥小鼠制模后不同時(shí)間點(diǎn)腸道組織中TNF-α、IL-6和HMGB1等促炎細(xì)胞因子、氧化產(chǎn)物MDA和8-iso-PGF2α的水平和MPO以及凋亡蛋白active caspase3的活性，并提高腸道組織中抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平和抗氧化酶SOD和CAT的活性。
　　結(jié)論：氫氣吸入治療能夠有效改善重度膿毒癥小鼠的腸道損傷并提高存活率，其對(duì)重度膿毒

9、癥導(dǎo)致的腸道損傷的保護(hù)作用與抑制腸道組織的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)二：氫氣吸入對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道上皮細(xì)胞功能的影響及機(jī)制
　　目的：Rho蛋白是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重要的中間信號(hào)分子，Rho蛋白及其下游效應(yīng)蛋白通過(guò)調(diào)控腸道上皮細(xì)胞間緊密連接和粘附連接的穩(wěn)定狀態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞屏障功能和腸粘膜通透性。本實(shí)驗(yàn)擬觀察氫氣吸入治療對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙的改善作用并探討其對(duì)腸道組織Rho蛋白信號(hào)通路的

10、影響。
　　方法：成年雄性ICR小鼠，6~8周齡，體重20~25g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、假手術(shù)+氫氣吸入組（氫氣對(duì)照組）、重度膿毒癥組（模型組）和重度膿毒癥+氫氣吸入組（氫氣治療組）。采用CLP法制備重度膿毒癥動(dòng)物模型并且分別于制模后1h和6h給予氫氣對(duì)照組和氫氣治療組小鼠吸入2%氫氣各1h。于制模后24h時(shí)分別進(jìn)行如下檢查測(cè)定各組小鼠腸道屏障功能：采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐（FITC-右旋糖酐）通過(guò)率法檢測(cè)腸粘膜

11、通透性改變；取血液以及肝臟、脾臟和腎臟等內(nèi)臟組織勻漿后在細(xì)菌培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)腸道細(xì)菌移位情況；利用透射電鏡（TEM）觀察腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接和粘附連接等超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變；采用免疫蛋白印跡（Western blot）法和免疫熒光染色法（immunofluorescence，IF）測(cè)定小鼠腸道上皮細(xì)胞主要緊密連接蛋白和粘附連接蛋白的表達(dá)與分布。于制模后24h取回腸組織采用GST Pull-Down法測(cè)定Rho蛋白活性，

12、并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法
　?。╥mmunohistochemistry，IHC）觀察各組小鼠回腸組織中ROCK1和mDia1的定位和表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.氫氣吸入治療可明顯降低重度膿毒癥小鼠制模后24h血清FITC-右旋糖酐的含量和血液、肝臟、脾臟和腎臟組織細(xì)菌培養(yǎng)基中菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）數(shù)目，并明顯改善腸道上皮細(xì)胞及細(xì)胞間連接等超微結(jié)構(gòu)的病理形態(tài)改變和腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白

13、和粘附連接蛋白的表達(dá)與分布。2.氫氣吸入治療可顯著降低重度膿毒癥小鼠制模后24h腸道組織中Rho蛋白活性和ROCK1的表達(dá)，而明顯提高mDia1的表達(dá)。
　　結(jié)論：氫氣吸入治療可有效改善重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙，其機(jī)制可能為氫氣通過(guò)調(diào)控腸道組織Rho蛋白信號(hào)通路進(jìn)而改善腸道上皮細(xì)胞間的連接功能。
　　實(shí)驗(yàn)三：Rho蛋白信號(hào)通路在氫氣改善重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙中的作用機(jī)制
　　目的：ROCK和mDia均參與

14、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組，在維持腸道上皮細(xì)胞的正常形態(tài)和極性以及細(xì)胞間連接的穩(wěn)定狀態(tài)可發(fā)揮不同甚至相反的作用[7]，本實(shí)驗(yàn)擬探討Rho蛋白及其主要下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK1和mDia1在氫氣改善重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙中的具體作用。
　　方法：成年雄性ICR小鼠，6~8周齡，體重20~25g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為重度膿毒癥組（模型組）、重度膿毒癥+Rho蛋白抑制劑組（Rho抑制劑組）、重度膿毒癥+ROCK抑制劑組（ROCK抑制劑組

15、）和重度膿毒癥+氫氣吸入組（氫氣治療組）。通過(guò)CLP法制作重度膿毒癥模型小鼠。Rho抑制劑組和ROCK抑制劑組小鼠于制模前30min分別經(jīng)腹腔注射Rho活性蛋白抑制劑C3胞外酶100μg/kg和ROCK特異性抑制劑Y-276325mg/kg，模型組和氫氣治療組則于相同時(shí)間點(diǎn)接受腹腔注射生理鹽水5mL/100g。氫氣治療組小鼠于制模后1h和6h各吸入2%氫氣1h行氫氣吸入治療。觀察制模后7d內(nèi)四組小鼠的存活情況并計(jì)算存活率。于制模后24h

16、時(shí)取回腸組織，分別測(cè)定各組小鼠腸道組織中TNF-α、IL-6和HMGB1等促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平；測(cè)定腸道組織中MPO、抗氧化酶SOD、CAT和凋亡蛋白active caspase3的活性；測(cè)定腸道組織中氧化產(chǎn)物MDA、8-iso-PGF2α的含量。于制模后24h采用FITC-右旋糖酐通過(guò)率法檢測(cè)腸粘膜通透性改變并取血液、肝臟、脾臟和腎臟組織勻漿后進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)并檢測(cè)細(xì)菌移位情況。于制模后24h時(shí)取回腸組織，行HE

17、染色觀察腸道組織病理學(xué)改變并評(píng)分，另外通過(guò)透射電鏡觀察腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞間連接等超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變；采用Western blot法和免疫熒光染色法檢測(cè)腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和粘附連接蛋白的表達(dá)與分布。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組通過(guò)Western blot法分別測(cè)定腸道組織中ROCK1和mDia1的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.模型組和Rho抑制劑組小鼠7d存活率均為0；ROCK抑制劑組和氫氣吸入治療組小鼠7d內(nèi)的存活率明顯提高，分別為4

18、0%和50%。2.于制模后24h， ROCK抑制劑和氫氣吸入治療均明顯降低重度膿毒癥小鼠腸道組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和HMGB1以及氧化產(chǎn)物MDA、8-iso-PGF2α的水平，降低MPO和凋亡蛋白active caspase3的活性，同時(shí)提高腸道組織中抗氧化酶SOD和CAT的活性。此外，氫氣治療組小鼠腸道組織中抗炎性細(xì)胞因子IL-10的水平明顯提高；應(yīng)用Rho抑制劑則對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道組織的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡

19、等情況無(wú)明顯改善作用。3.于制模后24h，ROCK抑制劑和氫氣吸入治療均可明顯降低重度膿毒癥小鼠血清FITC-右旋糖酐的含量和血液及內(nèi)臟組織細(xì)菌培養(yǎng)基中菌落形成單位數(shù)目，改善腸道組織病理學(xué)損傷并降低病理?yè)p傷評(píng)分，改善腸道上皮細(xì)胞及細(xì)胞間連接等超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)病理改變和腸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白和粘附連接蛋白的表達(dá)與分布；未見(jiàn)Rho抑制劑應(yīng)用對(duì)重度膿毒癥小鼠上述腸道屏障功能檢測(cè)指標(biāo)的改善作用。4.于制模后24h，ROCK抑制劑和氫氣吸入治療

20、均可顯著降低重度膿毒癥小鼠腸道組織Rho蛋白活性和ROCK1的表達(dá)并明顯提高mDia1的表達(dá)；而Rho抑制劑組小鼠腸道組織中ROCK1和mDia1的表達(dá)顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：氫氣吸入治療通過(guò)上調(diào)mDia1表達(dá)同時(shí)下調(diào)ROCK1表達(dá)的方式調(diào)節(jié)Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改善重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙，從而抑制腸道組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕腸道組織病理?yè)p傷，并最終改善膿毒癥進(jìn)程，提高生存率。
　　小結(jié)：
　　1

21、.2%氫氣吸入治療能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Rho蛋白信號(hào)通路改善重度膿毒癥小鼠腸道上皮細(xì)胞屏障功能障礙，具體機(jī)制為氫氣通過(guò)上調(diào)mDia1的表達(dá)并下調(diào)ROCK1的表達(dá)增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞間有效連接的穩(wěn)定性發(fā)揮改善重度膿毒癥小鼠腸道屏障功能障礙的作用，從而抑制腸道組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕腸道病理?yè)p傷，改善膿毒癥病程及預(yù)后。
　　2.本研究中，2%氫氣吸入在對(duì)重度膿毒癥小鼠模型的治療過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，在發(fā)揮治療效應(yīng)的同時(shí)具有較高的