富氫培養(yǎng)液對脂多糖所致離體人腸上皮屏障功能障礙的影響及機制研究.pdf

1、目的：膿毒癥是由感染因素誘發(fā)并且以炎性反應為主的綜合征，是燒傷、創(chuàng)傷和大手術等的常見并發(fā)癥。腸上皮屏障能夠阻擋微生物、毒素等透過腸壁進入人體內其他組織、器官以及血液循環(huán)。腸屏障功能障礙是膿毒癥引發(fā)多器官功能障礙綜合征（MODS）的重要因素。緊密連接蛋白 occludin與黏附連接蛋白E-cadherin是腸上皮屏障的主要組成成分。內毒素脂多糖（LPS）通過改變緊密連接蛋白和黏附連接蛋白的正常表達，造成腸上皮屏障通透性增加，引發(fā)腸屏障功能

2、障礙。多項研究已經證實氫氣對多種膿毒癥動物模型具有明確的保護作用，但是其具體機制尚未明確。本實驗研究擬運用人結腸腺癌細胞系建立離體人腸屏障功能障礙模型，觀察富氫培養(yǎng)液在調節(jié) LPS誘發(fā)的腸屏障功能障礙中的作用，并深入探討其相關的作用機制。
　　方法：人結腸腺癌細胞系Caco2復蘇后傳代培養(yǎng)至第28-35代之間時用于實驗。
　　第一部分：建立Caco2細胞單層模型。首先分別采用不同濃度的LPS（1，10，100μg/ml和1

3、mg/ml）孵育，于不同時間點（0，3，6，12，24，48 h）檢測跨上皮電阻（TER）值和異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖的滲透系數(shù)（PE）。采用CCK-8法測定100μg/ml和1 mg/ml的LPS對Caco2細胞增殖活力的影響。隨機將細胞進行分組（4組）：對照（control）組、富氫培養(yǎng)液（H2）組、脂多糖（LPS）組和LPS+H2組。按分組處理，于孵24 h時，分別檢測TER值和PE。分別于孵育6、12和24 h時，采用West

4、ern blot法測定occludin與E-cadherin的表達水平；于孵育24 h時，采用免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的分布情況。
　　第二部分：首先按照第一部分的分組方法于孵育24h時，采用GST-Pulldown法測定Caco2細胞中Ras同源家族蛋白A（RhoA）的活性。細胞進行隨機分組（5組）：control組、LPS組、LPS+H2組、LPS+H2+RhoA激動劑CN03（LPS+H2+CN0

5、3）組、LPS+RhoA抑制劑C3胞外酶（LPS+C3）組。Control組、LPS組以及LPS+H2組處理同第一部分。LPS+H2+CN03組中，于孵育前3 h時加入1μg/ml的CN03。LPS+ C3組中，于孵育前1 h時加入2.5μg/ml的C3胞外酶。于孵育24 h時測定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的表達與分布情況。
　　第三部分：首

6、先按照第一部分的分組方法于孵育24h時，Western blot法測定哺乳動物Diaphanous相關成蛋白1（mDia1）的表達水平。慢病毒法轉染Caco2細胞，對mDia1進行RNA干擾，并獲取穩(wěn)定轉染細胞株。將細胞隨機分為5組：control組、LPS組、RNA干擾（siRNA mDia1）組、LPS+H2組和siRNA mDia1+LPS+H2組。其中，control組、LPS組和LPS+H2組處理同前；siRNA mDia1組

7、和siRNA mDia1+LPS+H2組使用穩(wěn)定表達mDia1干擾片段的Caco2細胞。于孵育24 h時測定腸屏障模型的TER值與PE。分別采用Western blot法和免疫熒光法測定occludin與E-cadherin的表達與分布情況。
　　結果：第一部分：與0μg/ml LPS組比較，100μg/ml和1 mg/ml的LPS孵育6-48 h的時間范圍內，TER值下降且PE均降低升高，趨勢呈現(xiàn)出時間依賴性，并且在24 h時變

8、化程度最為明顯；100μg/ml LPS對細胞活力無顯著影響，而1mg/ml LPS組中細胞活力顯著降低。Control組與H2組比較，上述各指標間差異均無統(tǒng)計學意義。與control組比較，在LPS組孵育24 h時腸屏障模型的TER值降低， PE升高；孵育6-24 h時，occludin和E-cadherin的表達均下調；孵育24 h時， occludin和E-cadherin在細胞膜處分布減少，在細胞質中分布增多，“鐵絲網”樣形態(tài)的

9、連續(xù)性與完整性破壞。與LPS組比較，LPS+H2組孵育24 h時腸屏障模型的TER值升高，PE降低；孵育6-24 h時，occludin和E-cadherin的表達均上調；孵育24 h時，occludin和E-cadherin在細胞膜處分布增多，在細胞質中分布減少，“鐵絲網”樣形態(tài)的連續(xù)性與完整性改善。
　　第二部分：與control組比較，LPS組中RhoA活性升高；與LPS組比較， LPS+H2組中RhoA活性降低。與LPS+

10、H2組比較，LPS+H2+CN03組中TER值降低且PE升高，occludin和E-cadherin表達下調，且分布紊亂。與LPS組比較，LPS+C3組中，TER值升高且PE降低，occludin和E-cadherin的表達上調，分布情況改善。
　　第三部分：與control組比較，LPS組mDia1表達降低，LPS+H2組mDia1表達升高。與control組比較，siRNA mDia1組TER值降低且PE升高，occludin