小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素對艱難梭菌的體外及體內(nèi)抗菌活性研究.pdf

1、艱難梭菌（Clostridium difficile）為革蘭染色陽性產(chǎn)芽孢厭氧桿菌，可引起抗菌藥物相關(guān)性腹瀉及假膜性腸炎(Pseudomembranous colitis，PMC)，統(tǒng)稱為艱難梭菌相關(guān)性腹瀉（Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD）。近十年來，由于艱難梭菌毒力的改變，尤其是艱難梭菌高毒株027及078的流行，北美和歐洲艱難梭菌感染發(fā)病率和死亡率顯著上升。艱難梭菌是醫(yī)

2、院獲得性腹瀉的最主要病原菌。雖然目前國內(nèi)沒有全國性的監(jiān)測資料，但對局部地區(qū)的研究顯示國內(nèi)CDAD并不少見，發(fā)病率約為15-17例次/10000住院病人，與國外非暴發(fā)流行期發(fā)病率相仿。
　　CDAD特別是復(fù)發(fā)性感染的治療方案數(shù)十年來進展不大，迄今為止仍是醫(yī)學(xué)界的難題。歐洲ESCMID及美國IDSA發(fā)布艱難梭菌指南推薦的主要治療用藥仍然是甲硝唑及萬古霉素，但已有有效率降低且復(fù)發(fā)率增高的報道，同時萬古霉素耐藥腸球菌（Vancomycin

3、-resistant Ent erococcus，VRE）較高的檢出率也限制了萬古霉素的應(yīng)用。美國FDA2011年新批準(zhǔn)的非達(dá)霉素對艱難梭菌具有良好的抗菌活性，然其價格昂貴，且目前國內(nèi)沒有上市。其他治療方法，如服用益生菌甚至正常人糞便灌腸等重建腸道正常菌群有一定療效，毒素吸附劑的作用仍有爭議，而免疫治療如單克隆抗體和疫苗還處于研究階段。因此尋找新的治療方案就成為當(dāng)務(wù)之急。
　　小檗堿(黃連素，Berberine，Ber)是從黃連等

4、植物中提取的一種異喹啉類生物堿。黃連用于治療腹瀉在中國已有數(shù)千年歷史。有報道顯示小檗堿在體外對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌有抑制或殺滅作用，并可減少細(xì)菌毒素的釋放，在體內(nèi)對小鼠腸道損傷亦具有保護作用。此外有研究報道小檗堿與苯唑西林具有協(xié)同抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）作用。
　　基于上述背景提出本課題。本課題將應(yīng)用多種研究方法對小檗堿單用或

5、聯(lián)合萬古霉素對艱難梭菌的體內(nèi)和體外抗菌活性進行研究，以期為艱難梭菌腹瀉的治療提供新的方向。
　　課題研究分以下兩部分:
　　一、小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素對艱難梭菌的體外抗菌活性研究。
　　二、小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素在金黃地鼠艱難梭菌相關(guān)性腹瀉模型中的療效。
　　第一部分、小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素對艱難梭菌的體外抗菌活性研究
　　收集2008至2009年復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院臨床分離的50株艱難梭菌，采用瓊脂

6、稀釋法測定小檗堿與萬古霉素對50株艱難梭菌臨床分離株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC);采用棋盤法對該50株菌株進行體外聯(lián)合藥敏測定，并選取部分有協(xié)同或相加作用的菌株用E-test方法進行驗證。選取1株萬古霉素耐藥臨床株SH9、1株萬古霉素敏感性下降臨床株SH178、1株標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌ATCC43596c、1株瑞典臨床株（核糖核酸型027），采用菌落計數(shù)法進行小檗堿（64mg/L

7、和128mg/L）和萬古霉素單藥(1/2MIC-2 MIC)及聯(lián)合用藥的體外殺菌實驗，繪制殺菌曲線。利用相差顯微鏡計算小檗堿和萬古霉素單藥(1/4MIC-2 MIC)及聯(lián)合用藥后艱難梭菌產(chǎn)芽孢率。
　　小檗堿單藥對艱難梭菌的MIC50為512mg/L，MIC90為＞512mg/L;萬古霉素單藥對艱難梭菌的MIC50為0.5mg/L，MIC90為1mg/L，其中有3株菌對萬古霉素呈耐藥(MIC=4mg/L)。小檗堿和萬古霉素聯(lián)用對5

8、0株艱難梭菌呈協(xié)同、相加、無關(guān)作用的菌株分別為12％、80％、8％，未發(fā)現(xiàn)有拮抗作用菌株，E-test法結(jié)果與棋盤法結(jié)果基本一致。體外殺菌曲線結(jié)果示兩藥不同濃度聯(lián)合對臨床株027、SH9及SH178菌株多呈相加作用，對標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌ATCC43596c呈無關(guān)作用。與萬古霉素單藥相比，小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥可降低艱難梭菌產(chǎn)芽孢率。
　　上述結(jié)果顯示小檗堿單用對艱難梭菌抗菌活性較弱，與萬古霉素聯(lián)合對艱難梭菌多呈相加作用;小檗堿與萬

9、古霉素聯(lián)合用藥較萬古霉素單藥產(chǎn)芽孢率低。
　　第二部分、小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素在金黃地鼠艱難梭菌相關(guān)性腹瀉模型中的療效
　　建立克林霉素誘導(dǎo)的金黃地鼠艱難梭菌腹瀉模型，并對小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素對金黃地鼠艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的療效進行評價。實驗菌株為艱難梭菌高毒株027菌株;實驗動物為金黃地鼠，雌性，體重809左右，31只，分5組:小檗堿單藥組（7只），萬古霉素單藥組（7只），小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥組（7只），不給藥對照

10、組及健康對照組（各5只）。急性感染觀察期至給予艱難梭菌（灌胃）后第7天，觀察終點為給予艱難梭菌后第27天，觀察金黃地鼠大便性狀、體重改變，比較不同組別的存活率，繪制生存曲線。瀕死地鼠及觀察終點仍存活地鼠乙醚麻醉處死后解剖取結(jié)腸及盲腸組織HE染色，并取腸內(nèi)容物進行細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定。
　　金黃地鼠健康對照組實驗全程無腹瀉，體重?zé)o下降，至觀察終點無死亡。不給藥對照組艱難梭菌灌胃后1-2天全部出現(xiàn)腹瀉癥狀，至第3天全部死亡，體重減輕19.9

11、％±8.6％。小檗堿單藥組艱難梭菌灌胃后1-2天全部出現(xiàn)腹瀉癥狀，至第3天全部死亡，體重減輕14.1％±6.4％。萬古霉素單藥組艱難梭菌灌胃后1-2天部分出現(xiàn)腹瀉癥狀，感染后存活者第4-5天腹瀉好轉(zhuǎn)，至初次感染觀察終點體重下降-2.4％±5.8％，初次感染存活率57.1％，復(fù)發(fā)率為75％，至第27天總存活率為14.3％。小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥組在給予艱難梭菌灌胃后1-2天部分出現(xiàn)腹瀉癥狀，感染后存活者第4-5天腹瀉好轉(zhuǎn)，初次感染觀察終

12、點體重下降約1.1％±5.3％，初次感染存活率為71.4％，復(fù)發(fā)率為20％，至第27天總存活率為57.1％。取所有金黃地鼠的結(jié)腸內(nèi)容物做艱難梭菌培養(yǎng)、毒素檢測及Ribotyping基因分型，均為實驗菌株。各組別之間結(jié)腸組織病理學(xué)損傷無顯著差異。
　　上述結(jié)果顯示雖然小檗堿單藥對金黃地鼠CDAD療效差，但小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥可降低金黃地鼠CDAD復(fù)發(fā)率，提高總存活率。
　　綜上所述，本課題研究結(jié)果顯示:
　　1.小檗

13、堿單用對艱難梭菌體外及體內(nèi)抗菌活性弱;
　　2.小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥對艱難梭菌呈相加作用;
　　3.小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥較萬古霉素單藥產(chǎn)芽孢率低;
　　4.小檗堿與萬古霉素聯(lián)合用藥可降低金黃地鼠CDAD復(fù)發(fā)率，提高存活率。
　　本課題在國內(nèi)外首次對小檗堿單用或聯(lián)合萬古霉素對艱難梭菌體外與體內(nèi)抗菌作用進行了系統(tǒng)評價，為今后CDAD提供了新的臨床治療方向，改善預(yù)后減少復(fù)發(fā)。如今后能經(jīng)過符合GCP規(guī)范的臨床試驗