人源GPCRs表達篩選和LPAR5、NTSR2的表達純化與晶體生長嘗試.pdf

1、GPCRs是一類與G蛋白相連接的跨膜蛋白受體家族，具有7個跨膜螺旋，是體內(nèi)最大的膜受體蛋白家族，該家族受體成員數(shù)目已經(jīng)超過800個。它們廣泛參與各種生命活動、生理過程的調(diào)節(jié)。隨著對各種人類疾病分子機制的了解越來越清楚，發(fā)現(xiàn)GPCRs還涉及很多重要疾病的發(fā)生、發(fā)展，與疾病治療密切相關(guān)。GPCRs的結(jié)構(gòu)特征使其在信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，這為GPCRs成為很好的藥物靶標提供可能。
　　LPAR5和NTSR2蛋白分別屬于A類GPCRs

2、的α，β亞群，由七次跨膜α—螺旋、N端胞外段和C端胞內(nèi)段組成，它們可以識別并結(jié)合細胞外部環(huán)境中的信號分子，通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將胞外信號傳遞到細胞內(nèi)的下游效應(yīng)分子，引起細胞內(nèi)的—系列生理生化反應(yīng)。目前還沒有LPAR5和NTSR2蛋白及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，我們對LPAR5和NTSR2蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、信號通路及其調(diào)控機制等的了解還很不清楚，其生物學(xué)功能仍不明確。
　　本論文包括兩方面工作，前期工作是對人源GPCRs進行表達篩選，包括

3、14種人源GPCRs進行克隆構(gòu)建、試表達Western Blot檢測和小量表達的純化。從中篩選到表達較好的LPAR5和NTSR2兩個蛋白。后期工作主要針對LPAR5和NTSR2蛋白進行克隆、表達、純化。克隆構(gòu)建包括突變體、融合蛋白（Bril或T4L）和截短體這些方面的工作，獲得了LPAR5和NTSR2共33種亞克隆構(gòu)建體蛋白。所有構(gòu)建蛋白均進行小量表達和純化獲得有活性的蛋白，采用HPLC檢測蛋白的均一性。實驗結(jié)果:NTSR2-F347A

4、、NTSR2-1-B-410和NTSR2-1-B-384三個克隆可以看到單體峰，但還存在很大部分的寡聚峰。通過Thermofluor檢測蛋白的熱穩(wěn)定性，結(jié)果表明蛋白的熱穩(wěn)定性一般，需要繼續(xù)優(yōu)化改善。對NTSR2-1-B-384進行了大量表達純化，獲得活性蛋白嘗試LCP結(jié)晶。同時對已獲得較好性質(zhì)的蛋白繼續(xù)進行優(yōu)化構(gòu)建，將寡聚峰全轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w峰，增加表達量，熱穩(wěn)定性好（Tm約為60℃），獲得更好性質(zhì)的蛋白進行LCP結(jié)晶實驗。本文為人源LPAR