布氏錐蟲eIF4E蛋白的表達純化與晶體生長.pdf

1、論文由布氏錐蟲eIF4E蛋白和斑馬魚MO25蛋白初步晶體學(xué)研究兩部分組成。
　　布氏錐蟲屬動基體目、錐蟲科中的錐蟲屬，是致病的鞭毛原蟲寄生，可引發(fā)嚴(yán)重的傳染病。在人類中主要為昏睡病，南美錐蟲病和利什曼病，流行于非洲，通過采采蠅傳播。對人類和其他動物健康造成極大的干擾。目前，對這些寄生蟲有效的疫苗的開發(fā)仍是一個難以實現(xiàn)的目標(biāo)，而臨床治療手段僅限于化療。常規(guī)藥物的成本，毒性和抗藥性問題導(dǎo)致迫切需要確定和開發(fā)新的治療方向，而此關(guān)鍵是確立

2、新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)和新的藥物靶標(biāo)。
　　真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)最初發(fā)現(xiàn)時為分子量為25KD的多肽。主要分布在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)分布少量，與mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，在帽子依賴性翻譯和mRNA輸出發(fā)揮重要的調(diào)控作用。它多以游離或形成復(fù)合物存在，它能被其他蛋白所調(diào)節(jié)，如與支架蛋白eIF4G結(jié)合作為eIF4F復(fù)合物的一部分介導(dǎo)發(fā)揮

3、其功能以及能夠結(jié)合eIF4E蛋白遠(yuǎn)端背側(cè)表面到帽子結(jié)合位點，并能調(diào)節(jié)帽子結(jié)合活性4EBPs(eIF4E binding proteins)蛋白。這兩種蛋白質(zhì)可增加eIF4E蛋白與5'cap結(jié)合的親和力。在布氏錐蟲中，真核生物翻譯起始因子eIF4E(TbeIF4E)分為四個亞型(TbeIF4E1-4)，同時它們在生物體內(nèi)，行使不同功能。
　　目前布氏錐蟲的eIF4E蛋白結(jié)合相關(guān)蛋白和調(diào)控翻譯過程的途徑仍然不清晰。因此我們構(gòu)建了布氏錐

4、蟲eIF4E1(1-233aa)-C-His-pET22b，eIF4E2(1-251aa)-C-His-pET22b, eIF4E3(1-442aa)-C-His-pET28a,eIF4E4(1-427aa)-C-His-pET22b重組表達質(zhì)粒。通過表達檢測只獲得eIF4E1的可溶性蛋白。再經(jīng)過Ni-NTA親和層析柱進行純化和Superdex200凝膠過濾層析后，SDS-PAGE檢測后收集純度較高較均一的蛋白坐滴氣象擴散法進行晶體生長

5、。
　　MO25是一種保守的支架蛋白，它與假激酶STRAD共同激活腫瘤抑制基因LKB1從而發(fā)揮調(diào)控功能。MO25同樣也能促進STE20家族激酶MST3，MST4，STK25，SPAK以及OSR1的活性。因此，我們純化并結(jié)晶了斑馬魚的MO25(DrMO25)蛋白，然后采用X射線衍射，獲得晶體衍射分辨率達到2.9(A)。此結(jié)構(gòu)屬于空間群為P3221，晶胞參數(shù)為a=b=156.665(A)，c=221.251(A)。此外，通過分子置換的