重組IGFBP-4蛋白的表達(dá)、純化、晶體生長(zhǎng)及其對(duì)鹿茸細(xì)胞增殖抑制的研究.pdf

1、研究背景與目的： 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-4(insulin-likegrowthfactorbindingprotein-4，IGFBP-4)作為一個(gè)重要的細(xì)胞因子，具有多種重要的生理功能。它既是構(gòu)成動(dòng)物GH/IGF生長(zhǎng)軸的一個(gè)重要成員，同時(shí)又是一個(gè)重要的抗癌蛋白，對(duì)絕大多數(shù)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。對(duì)IGFBP-4的研究受到越來(lái)越廣泛的重視。鹿茸是一種神奇的名貴中藥，不僅具有其獨(dú)特的藥用價(jià)值，而且具

2、有重要的科學(xué)研究意義。在動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中，脊椎動(dòng)物逐漸失去了肢體附屬器官再生的能力，但鹿茸角作為一種復(fù)雜的哺乳動(dòng)物附屬器官，卻能每年從角柄上脫落和完全再生。而且鹿茸生長(zhǎng)速度之快在哺乳動(dòng)物組織生長(zhǎng)中也是絕無(wú)僅有的。鹿茸角為我們研究哺乳動(dòng)物組織器官的再生、創(chuàng)傷修復(fù)以及癌癥發(fā)生等提供了理想模型。 本研究通過(guò)克隆人IGFBP－4cDNA、構(gòu)建原核表達(dá)載體、并進(jìn)行高效表達(dá)和純化，利用基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)重組蛋白；利用純化的重組IGFBP-4

3、蛋白進(jìn)行晶體生長(zhǎng)，為進(jìn)一步解析其三維結(jié)構(gòu)、研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)；利用體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)鹿茸細(xì)胞增殖分裂及凋亡的影響，為進(jìn)行鹿茸再生機(jī)理的深入研究開(kāi)辟了新的途徑。 材料與方法： 根據(jù)GenBank中人IGFBP-4成熟肽的cDNA序列，結(jié)合表達(dá)載體pGEX-6P-1的特點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成一對(duì)特異性引物。采用PER的方法擴(kuò)增人成熟IGFBP-4蛋白cDNA片段，然后將其定向克隆劍載體pGEX-6P-1中，構(gòu)建原核

4、表達(dá)重組載體pGEX-6p-1-BP4；重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α擴(kuò)增、提取后，用PCR、限制性?xún)?nèi)切酶酶切以及DNA序列測(cè)定等方法進(jìn)行鑒定。鑒定正確的陽(yáng)性pGEX-6p-1-BP4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)Amp抗性篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性工程菌；以IPTG誘導(dǎo)工程菌高效表達(dá)重組蛋白IGFBP-4，利用GST親合層析、瓊脂糖凝膠層析對(duì)重組IGFBP4蛋白進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行Westernblot檢測(cè)；最后通過(guò)晶體生長(zhǎng)和

5、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)重組IGFBP4蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、成功的構(gòu)建了IGFBP-4cDNA原核表達(dá)載體pGEX-6p-1-BP4；建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化pGEX-6p-1-BP4重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞株BL21-pGEX-6p-1-BP4，并使IGFBP-4cDNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)獲得高效穩(wěn)定表達(dá)。 2、確立了工程菌以可溶性形式高效表達(dá)重組IGFBP4蛋白的培養(yǎng)條件。重組工程菌pGEX-IGFBP-4/

6、BL21(DE3)的最佳表達(dá)條件確定為；溫度16℃、IPTG濃度為0.6mM、誘導(dǎo)時(shí)間為20小時(shí)。建立了高效純化重組IGFBP4蛋白的工藝，較好地純化出了IGFBP-4蛋白，蛋白質(zhì)純度達(dá)到97％以上，為以后進(jìn)行IGFBP4蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究創(chuàng)造了條件。 3、本研究在生長(zhǎng)溫度為13℃，18％聚乙二醇8000，0.2mol/L醋酸鈣，0.1M二甲胂酸鈉，pH6.5條件下，成功地生長(zhǎng)了重組IGFBP-4蛋白的晶體，并進(jìn)行了晶體生長(zhǎng)條

7、件的優(yōu)化，得到了可供蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析所需要的蛋白質(zhì)晶體。 4、首次發(fā)現(xiàn)IGFBP－4蛋白對(duì)鹿茸細(xì)胞的增殖抑制作用，為進(jìn)一步研究其在鹿茸生長(zhǎng)和再生中的作用、闡明GH/IGF軸的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理開(kāi)辟了新的可能途徑。 結(jié)論： 本研究利用基因工程技術(shù)成功的構(gòu)建了IGFBP-4cDNA原核表達(dá)載體，獲得了穩(wěn)定高效表達(dá)可溶性重組IGFBP-4的工程菌；經(jīng)過(guò)GST親合層析和瓊脂糖凝膠過(guò)濾層析對(duì)重組IGFBP4蛋白進(jìn)行分離純化，獲