人類致病相關(guān)毛孢子菌表型和種系發(fā)生特征及種間鑒定方法的比較研究.pdf

1、多年以來，毛孢子菌僅做為皮膚淺部感染的毛結(jié)節(jié)菌病的病原體而為人們所了解。近年，隨著免疫缺陷人群的不斷擴(kuò)大，以阿薩希毛孢子菌為代表的毛孢子菌屬各菌種引起人類侵襲性感染的比例不斷增加。由于毛孢子菌屬多年來分類的簡化以及生化鑒定資料的缺乏，該菌屬準(zhǔn)確的種間鑒定和不同菌種致病力及耐藥性的差異等問題一直是困擾臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)真菌研究者的難題。準(zhǔn)確的種間鑒定對準(zhǔn)確把握該菌屬不同菌種引起的真菌感染性疾病的流行病學(xué)、易感部位、臨床表現(xiàn)及治療等方面具有重要

2、意義。本文從1例陰道定植的墨汁毛孢子菌的分離鑒定開始，圍繞毛孢子菌屬中部分與人類致病相關(guān)菌種的表型特征、分子進(jìn)化特征、各種種間鑒定方法在毛孢子菌屬鑒定中的作用等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的比較研究。文章分為五個(gè)部分： 第一部分：報(bào)告1例墨汁毛孢子菌的陰道定植病例并對該菌進(jìn)行分離鑒定和臨床實(shí)驗(yàn)研究?；颊吲?，34歲，陰道分泌物增多伴異味2個(gè)月就診。臨床實(shí)驗(yàn)室檢查可見乳白色均質(zhì)化分泌物附著于陰道壁黏膜，陰道分泌物Nugent評分5～6分。先后

3、2次陰道分泌物培養(yǎng)均分離出淡黃色有皺褶的酵母樣菌落。該菌在42℃可生長，玻片玉米瓊脂小培養(yǎng)見菌絲頂端附著胞形成及典型八疊球菌樣結(jié)構(gòu)，最佳生長培養(yǎng)基為酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基(YMA)，脲酶試驗(yàn)陽性，API20C AUX和分子測序鑒定證實(shí)為墨汁毛孢子菌(Trichosporon inkin)；該菌對兩性霉素B和克霉唑、氟康唑等唑類藥物敏感，對氟胞嘧啶和卡泊芬凈耐藥。這是國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)毛孢子菌在陰道內(nèi)的定植，其準(zhǔn)確鑒定有賴于表型特征、生化反應(yīng)及分

4、子測序的綜合分析。 第二部分：對不同標(biāo)本來源的墨汁毛孢子菌分別采用rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)和基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(IGS1)測序，ITS和IGS1區(qū)PCR限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR—RFLP)和基因組DNA的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)等方法，進(jìn)行墨汁毛孢子菌分子特征及種內(nèi)分型研究。結(jié)果顯示，不同標(biāo)本來源的rDNA—ITS和IGS1的序列相似性均高達(dá)100％，RFLP酶切圖譜具有較高的種內(nèi)一致性；不同菌株的RAPD

5、圖譜不盡相同。研究表明：rDNA—IGS1區(qū)測序及RFLP多酶切較適合于墨汁毛孢子菌的菌種分子鑒定，而基因組DNA的RAPD則更適合于菌種的種內(nèi)分型。 第三部分：對臨床收集到的阿薩希毛孢子菌、星形毛孢子菌、皮樣毛孢子菌、墨汁毛孢子菌、真皮毛孢子菌、T．domesticum、T．jirovecii和T．debeurmannianum等8種14株毛孢子菌進(jìn)行最適培養(yǎng)基生長試驗(yàn)、單菌落體視顯微鏡形態(tài)觀察、玉米瓊脂玻片小培養(yǎng)、溫度耐受試

6、驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、放線菌酮耐受試驗(yàn)、生化鑒定和體外藥敏試驗(yàn)等生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、生理生化等表型特征的比較，探索不同毛孢子菌表型上的種間差異性。結(jié)果顯示，不同毛孢子菌的大體菌落形態(tài)差異不明顯，但單菌落形態(tài)各具特征；玻片小培養(yǎng)部分菌種可見附著胞、巨孢子和八疊球菌等特征性結(jié)構(gòu)，菌絲構(gòu)型及出芽方式也有助于種間鑒別；不同菌種溫度耐受試驗(yàn)和放線菌酮耐受試驗(yàn)存在一定的差異，但不足以區(qū)別所有的菌種，墨汁毛孢子菌的溫度耐受性最高，真皮毛孢子菌和星形毛孢子菌的放線

7、菌酮耐受性最強(qiáng)；阿薩希毛孢子菌和墨汁毛孢子菌的生化鑒定準(zhǔn)確率均達(dá)100％，但可靠性僅為80％和66.7％，其他菌種均無法實(shí)現(xiàn)生化方法的準(zhǔn)確鑒定；所有的毛孢子菌均對5—氟胞嘧啶和卡泊芬凈耐藥，大多數(shù)阿薩希毛孢子菌株對兩性霉素B、氟康唑和伊曲康唑耐藥但對伏立康唑敏感，真皮毛孢子菌則對所有的唑類藥物耐藥而對兩性霉素B敏感。研究表明，體視顯微鏡下單菌落形態(tài)觀察有助于毛孢子菌表型的種間鑒定，生化鑒定僅能對少數(shù)毛孢子菌實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定，不同種的毛孢子菌

8、對抗真菌藥物的敏感性存在較大差異，準(zhǔn)確的種間鑒定和體外藥敏試驗(yàn)對毛孢子菌深部感染的臨床藥物選擇具有重要意義。 第四部分：通過rDNA—ITS和IGS1測序及種系進(jìn)化分析，對8株14株毛孢子菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和種系進(jìn)化研究，并對中國來源的阿薩希毛孢子菌進(jìn)行基因型分類，對日本毛孢子菌和星形毛孢子菌的種系發(fā)生關(guān)系進(jìn)行比較研究。結(jié)果顯示，rDNA—ITS和IGS1測序能夠較準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)14株毛孢子菌的分子種間鑒定，rDNA—ITS為基礎(chǔ)

9、的種系發(fā)生樹能準(zhǔn)確區(qū)分日本毛孢子菌和星形毛孢子菌以外的其他人類致病相關(guān)的毛孢子菌，而rDNA—IGS1的種系發(fā)生樹能準(zhǔn)確區(qū)分所有人類致病相關(guān)毛孢子菌的差異。中國來源的阿薩希毛孢子菌多屬于基因型Ⅰ和Ⅳ，首次發(fā)現(xiàn)以往從未報(bào)告的基因型Ⅶ。而日本毛孢子菌和星形毛孢子菌的鑒定目前存在很多混亂，研究中的星形毛孢子菌臨床株可能是介于日本毛孢子菌和星形毛孢子菌間的新種或新的變種。 第五部分：采用rDNA—ITS—RFLP和rDNA—IGS1—R

10、FLP多酶切技術(shù)構(gòu)建8種14株毛孢子菌的酶切譜系并進(jìn)行聚類分析，嘗試將該方法用于人類致病相關(guān)毛孢子菌的快速種間鑒定。結(jié)果顯示，rDNA—ITS—RFLP多酶切可有效地將8種毛孢子菌分為不同進(jìn)化分枝的4個(gè)亞群，而rDNA—IGS1—RFLP多酶切則可實(shí)現(xiàn)8種14株毛孢子菌準(zhǔn)確的種間鑒定，并實(shí)現(xiàn)對部分進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的阿薩希毛孢子菌基因型之間的區(qū)分。研究顯示，在毛孢子菌種間分子鑒定方面，rDNA—ITS—RFLP和rDNA—IGS1—RFLP多