泛素羧基末端水解酶-1及其I93M突變在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用.pdf

1、帕金森病(PD)是一種常見的、危害嚴(yán)重的中老年神經(jīng)變性疾病,其主要病理特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡和殘存神經(jīng)元內(nèi)路易小體(Lewy body)形成,臨床上以肌強(qiáng)直、震顫和運(yùn)動減少等為主要癥狀。PD病因及發(fā)病機(jī)制至今不明。一系列的研究結(jié)果表明泛素蛋白酶體(Ubiquitin Preteasome System,UPS)降解途徑的異常是導(dǎo)致PD發(fā)病的重要機(jī)制之一。而泛素羧基末端水解酶-1(UCH-L1)是UPS降解途徑中的一個重要的功

2、能酶。研究報(bào)道,在PD患者甚至阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者大腦內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有UCH-L1的下調(diào)和廣泛的氧化修飾,1998年Leroy等報(bào)道UCH-L1的193M突變可導(dǎo)致常染色體顯性遺傳性PD。因而對UCH-L1及其193M突變在PD的發(fā)病機(jī)制中的研究不僅對探討遺傳性PD而且對散發(fā)性PD的致病機(jī)制都具有重要意義。
　　 第一部分:抑制UCH-L1去泛素化酶功能對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH的毒性

3、作用及機(jī)制的探討
　　 193M突變?nèi)シ核鼗傅幕钚耘c野生型相比下降了約50％左右,故我們推測UCH-L1去泛素化酶功能受損可能會影響細(xì)胞的去泛素化過程而導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用。
　　 1.UCH-L1抑制劑LDN-57444作用于SK-N-SH細(xì)胞系抑制UCH-L1去泛素化酶活性；MTT檢測細(xì)胞活力、Hoechst染色檢測細(xì)胞核、流式細(xì)胞儀(Annexin V-PI)檢測凋亡細(xì)胞,結(jié)果顯示該抑制劑對細(xì)胞的毒性作用呈劑量依賴性

4、,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)正常的SK-N-SH細(xì)胞貼壁能力強(qiáng),細(xì)胞體積較大,神經(jīng)突起較明顯,加抑制劑24 h后細(xì)胞體積變小,突起減少變短,細(xì)胞貼壁能力減弱,隨著濃度增加細(xì)胞明顯變小變圓,突起幾乎消失,熒光顯微鏡下可見有明顯的核碎裂及凋亡小體。
　　 2.Western Blot檢測多聚泛素化蛋白、熒光定量檢測LIPS功能:經(jīng)UCH-L1抑制劑處理后,多聚泛素化蛋白含量明顯增加,引起UPS功能受損。
　　 3.Western

5、Blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip/Grp78、XBP-1、CHOP/Gadd153的表達(dá),三者在UCH-L1抑制劑作用后表達(dá)均升高,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了UCH-L1抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 4.α-synuclein是否通過UPS途徑降解還存在爭議。UCH-L1抑制劑作用于SK-N-SH細(xì)胞并沒有影響a-synuclein的水平,提示α-synuclein通過LIPS途徑降解的觀點(diǎn)還缺乏充足的證據(jù)。
　　 結(jié)論及

6、意義:UCH-L1的去泛素化酶功能對神經(jīng)元的存活和正常功能的維持具有重要作用,抑制其去泛素化酶功能,影響了UPS的功能,進(jìn)而導(dǎo)致多聚泛素化蛋白增加。積聚的多聚泛素化蛋白首先引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)繼而進(jìn)展為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超載反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。UCH-L1抑制劑雖然影響了UPS的功能,導(dǎo)致多聚泛素化蛋白增加,但沒有影響到α-synuclein的水平,提示α-synuclein通過YPS途徑降解的觀點(diǎn)還缺乏充足的依據(jù)。
　　 第二部分:UC

7、H-L41 I93M突變在PD致病機(jī)制中的作用
　　 1.在SH-SY5Y細(xì)胞系中過表達(dá)UCH-L1野生型及193M突變,用共聚焦顯微鏡觀察兩者在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、分布情況,結(jié)果顯示兩者在轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)且表達(dá)量豐富。UCH-L1野生型呈均勻一致分布,而193M突變分布不均勻,形成聚集體。
　　 2.免疫熒光顯示聚集體內(nèi)除了有UCH-L1(I93M)外,還有a-synuclein成分和骨架蛋白α-tubu

8、lin共存,這與路易小體性質(zhì)相似,且過表達(dá)I93M突變體對細(xì)胞有毒性作用,提示I93M突變形成的聚集體參與了導(dǎo)致PD機(jī)制。
　　 3.用Western Blot及免疫共沉淀方法研究I93M突變形成聚集體的因?yàn)?。MG132能夠阻止UCH-L1的降解,提示UCH-L1是通過UPS途徑降解的,而過表達(dá)后隨著時(shí)間的推移細(xì)胞內(nèi)會有UCH-L1(I3M)的堆積,而UCH-L1野生型則沒有,表明I93M突變后影響了其降解。免疫共沉淀顯示I93

9、M在降解途徑中的泛素化進(jìn)程受到影響。
　　 結(jié)論及意義:UCH-L1 I93M突變過表達(dá)對細(xì)胞是有毒性作用的。產(chǎn)生毒性作用的可能因?yàn)樵谟贗93M突變后的UCH-L1的泛素化進(jìn)程受到影響,不能通過UPS途徑正常降解導(dǎo)致其堆積。
　　 第三部分:UCH-L1 I93M突變對微管系統(tǒng)影響的初步研究
　　 1.與野生型UCH-L1相比,過表達(dá)UCH-L1 I93M突變后,破壞了細(xì)胞內(nèi)微管系統(tǒng)的正常的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。微管蛋白的染

10、色顯示正常的細(xì)胞具有復(fù)雜清晰的網(wǎng)絡(luò)骨架,而I93M過表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)骨架紊亂。
　　 2.微管系統(tǒng)是維持神經(jīng)元突起的必需的結(jié)構(gòu)成分,因而微管系統(tǒng)受到干擾后會導(dǎo)致神經(jīng)突起的退行性病變。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常細(xì)胞具有長的光滑的突起,而過表達(dá)I93M突變尤其形成大量聚集體的細(xì)胞內(nèi)的微管系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,使得正常的神經(jīng)突觸的形態(tài)無法維持,突起末端變鈍或者呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)。
　　 3.過表達(dá)I93M突變形成聚集體和微管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的破

11、壞,加重了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負(fù)擔(dān),有可能觸發(fā)錯誤折疊蛋白反應(yīng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。我們進(jìn)一步檢測錯誤折疊蛋白反應(yīng)觸發(fā)后的標(biāo)志性蛋白Bip/Grp78,過表達(dá)193M突變的細(xì)胞內(nèi)Bip/Grp78表達(dá)量明顯升高,提示錯誤折疊蛋白反應(yīng)觸發(fā)。
　　 結(jié)論及意義:UCH-L1 I93M突變過表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)形成聚集體并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,但是聚集體如何影響細(xì)胞功能的內(nèi)在機(jī)制還不明確。本研究在過表達(dá)UCH-L1I93M突變的細(xì)胞內(nèi)檢測到微管系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)紊亂,以及