腸黏膜屏障損傷對自身免疫性肝炎患者枯否細胞免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究.pdf

1、背景：自身免疫性肝炎(AIH)發(fā)病機制尚未闡明，目前認為是具有遺傳易感性個體在環(huán)境因素的誘發(fā)下喪失了對自身肝細胞的免疫耐受，通過激活多種針對肝臟自身抗原的免疫應(yīng)答引起了肝臟損傷。而枯否細胞(KC)作為定居在肝臟的巨噬細胞，在免疫耐受的形成和維持中具有重要作用。有研究認為KC被腸源性毒素激活，生物學(xué)功能發(fā)生改變并釋放一系列炎性因子，可進一步造成免疫耐受破壞。因此，明確AIH患者是否存在腸黏膜屏障損傷，細菌移位活化KC并誘導(dǎo)KC出現(xiàn)一系列生

2、物學(xué)功能改變，導(dǎo)致免疫耐受缺失，從而啟動免疫反應(yīng)值得進一步探討。
　　 目的：本研究擬評價AIH患者腸黏膜屏障功能，從Toll樣受體（TLR）激活的角度研究腸源性毒素活化KC的情況，進一步評價活化的KC細胞骨架相關(guān)蛋白、外周血單核細胞吞噬功能及抗原遞呈功能的變化情況，明確AIH患者腸黏膜屏障功能破壞及其對KC的影響以及KC生物學(xué)功能變化情況，將為揭示KC在免疫反應(yīng)中的作用提供理論依據(jù)，加深其在腸道—肝臟互作中的理解，而且將為深入

3、研究AIH的發(fā)病機制提供新的視角和思路。
　　 方法：①取我院2012年～2013年診斷為AIH行胃鏡檢查患者十二指腸降段黏膜組織，并留取患者外周血及糞便標本，同時設(shè)健康體檢者為對照組。檢測肝功能ALT水平;在光鏡下及電鏡下觀察十二指腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的病理變化并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析十二指腸黏膜組織中緊密連接蛋白ZO-1、occludin的表達水平;以細菌16SrDNA熒光定量PCR方法測定糞便中關(guān)鍵細菌的含量;采用鱟珠實驗測定血

4、漿內(nèi)毒素(LPS)水平。②取我院2011年～2013年診斷為AIH行肝活檢患者肝組織，同時取非酒精性脂肪性肝病行肝活檢患者肝組織設(shè)為對照組。采用Western blot檢測肝組織TLR4的表達量;采用免疫熒光雙標的方法確定KC上TLR4的表達情況。③采用Western blot檢測肝組織Rac1通路上下游VAV1和PAK1的表達量并采用免疫熒光雙標的方法明確其在KC上的表達情況;采用梯度離心法獲得外周血單個核細胞(PBMC)，用熒光抗體

5、偶聯(lián)的特異性抗體標記CD80、HLA-DR單核細胞表面分子，用流式細胞儀測定這兩種抗原遞呈分子在單核細胞表面的表達情況，從而判斷單核細胞的抗原遞呈能力;單核細胞通過CD14單克隆磁珠抗體分選獲得，將單核細胞與FITC標記的大腸桿菌共培養(yǎng)，利用流式細胞儀評價單核細胞的吞噬能力。
　　 結(jié)果：⑴ AIH肝功異常組、AIH肝硬化組血清ALT水平較健康對照組均明顯升高（AIH肝功異常組VS健康對照組為:263.7±57.2 U/L vs

6、22.3±5.7 U/L，P=0.000; AIH肝硬化組VS健康對照組為:286.4±36.8 U/L vs22.3±5.7 U/L，P=0.000）。⑵病理檢查發(fā)現(xiàn)AIH患者十二指腸黏膜微絨毛受損，變短，密度減低，上皮細胞間隙增寬，胞核固縮，且損傷程度與疾病嚴重程度一致。⑶AIH肝功正常組、AIH肝功異常組及AIH肝硬化組ZO-1蛋白均存在分布不均，并且胞質(zhì)染色程度較健康對照組明顯減低，4組染色評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=14.77

7、5，P=0.0389); AIH各組occludin染色散亂，染色程度明顯低于健康對照組，4組染色評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=16.351，P=0.0216)。⑷ AIH患者存在腸道菌群失調(diào)，最突出的改變?yōu)殡p歧桿菌和乳酸桿菌為代表的厭氧菌數(shù)量下降（P均＜0.05），大腸桿菌和腸球菌為代表的需氧菌數(shù)量變化不大;雙歧桿菌/大腸桿菌(Bifidobacteria/escherichia coli，B/E)值下降（P均＜0.05），且三組間兩兩

8、比較均有差異（P均＜0.05）。⑸AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組血漿LPS水平較健康對照組均升高（AIH肝功正常組VS健康對照組為:7.47±1.64 pg/ml vs5.26±0.86 pg/ml，P=0.026; AIH肝功異常組VS健康對照組為:9.75±1.53 pg/ml vs5.26±0.86 pg/ml，P=0.012; AIH肝硬化組VS健康對照組為:14.23±4.23pg/ml vs5.26±0.

9、86 pg/ml，P=0.006），AIH三組間兩兩比較均有差異（P均＜0.05）。⑹AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組肝組織TLR4蛋白表達量明顯高于對照組（P均＜0.05），且三組間兩兩比較均有差異(P均＜0.05)。⑺AIH患者組定位于KC上的TLR4明顯高于對照組。⑻AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組肝組織VAV1和PAK1蛋白表達量明顯高于對照組（P均＜0.05），且三組間兩兩比較均有差異（P均

10、＜0.05）。⑼AIH患者組定位于KC上的VAV1和PAK1明顯高于對照組;⑽AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組外周血單核細胞HLA-DR+細胞所占比例較對照組明顯降低（AIH肝功正常組VS對照組為:97.06±2.73％ vs99.21±0.52％，P=0.036:AIH肝功異常組VS對照組為:92.57±6.93％ vs99.21±0.52％，P=0.027;AIH肝硬化組VS對照組為:89.74±10.41％ vs

11、99.21±0.52％，P=0.018），AIH三組間兩兩比較均有差異(P均＜0.05);AIH肝功正常組、AIH肝功異常組、AIH肝硬化組外周血單核細胞CD80+細胞所占比例較對照組均明顯降低（AIH肝功正常組VS對照組為:79.15±10.29％ vs82.34±5.38％，P=0.032;AIH肝功異常組VS對照組為:74.72±10.74％ vs82.34±5.38％，P=0.019;AIH肝硬化組VS對照組為:70.84±12

12、.47％ vs82.34±5.38％，P=0.012），AIH三組間兩兩比較均有差異(P均＜0.05)。⑾AIH各組吞噬率較對照組均明顯降低（AIH肝功正常組VS對照組為:4.34±1.82％ vs6.14±2.23％，P=0.027; AIH肝功異常組VS對照組為:3.27±2.04％ vs6.14±2.23％，P=0.016; AIH肝硬化組VS對照組為:2.03±1.47％ vs6.14±2.23％, P=0.011），AIH三組

13、間兩兩比較均存在差異（P均＜0.05）。
　　 結(jié)論：①AIH患者腸黏膜上皮破壞、緊密連接蛋白減少、腸道菌群失調(diào)致腸黏膜屏障功能損傷，腸黏膜通透性增高致細菌移位，血漿LPS升高，且腸黏膜屏障損傷程度與肝臟發(fā)病嚴重程度相關(guān)，提示腸黏膜屏障功能受損與AIH的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。②AIH患者腸源性內(nèi)毒素LPS通過TLR4激活KC。③AIH患者KC的Rac1通路過度激活，結(jié)合外周血單核細胞抗原提呈能力減低，吞噬能力減低，推測患者單核-巨噬細胞