養(yǎng)殖對(duì)蝦病原性弧菌拮抗菌的篩選和效果評(píng)價(jià).pdf

1、第一部分：人工養(yǎng)殖對(duì)蝦可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量及組成分析。為深入了解人工養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和攜帶病毒情況，本部分應(yīng)用常規(guī)細(xì)菌分離、培養(yǎng)與純化，細(xì)菌16SrDNA序列分析的方法分析了我國(guó)山東、江蘇、韓國(guó)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）和中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneorpenaeus chinensis）腸道內(nèi)可培養(yǎng)細(xì)菌的總數(shù)、優(yōu)勢(shì)菌組成和數(shù)量，并用巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Nested polymerase ch

2、ain reaction，Nested PCR)方法檢測(cè)對(duì)蝦攜帶病毒情況。結(jié)果顯示各批次凡納濱對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦對(duì)蝦樣品腸道內(nèi)的可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)在105-109cfu/g之間，并對(duì)分離出的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行屬（種）鑒定，結(jié)果表明這些優(yōu)勢(shì)菌分別屬于乳球菌屬（Lactococcus sp.）、弧菌屬（Vibrio sp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp

3、.）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）、微小桿菌屬（Microbacterium sp.）。凡納濱對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦均有樣品檢測(cè)為WSSV陽(yáng)性，6批次WSSV陽(yáng)性對(duì)蝦樣品中均檢測(cè)到弧菌屬細(xì)菌，占可培養(yǎng)細(xì)菌比例為33％-93.58%。2批次 WSSV陽(yáng)性對(duì)蝦樣品中檢測(cè)到希瓦氏菌屬細(xì)菌，占可培養(yǎng)細(xì)菌比例為21.67%-34.21%。4批次WSSV陽(yáng)性對(duì)蝦樣品中檢測(cè)到發(fā)光桿菌屬細(xì)菌，占可培養(yǎng)細(xì)菌比例為21.03%-66.83%。

4、r>　　第二部分：抗哈維氏弧菌芽孢桿菌的篩選及其效果的研究。采用濾紙片法和共培養(yǎng)的方法篩選出4株芽孢桿菌對(duì)哈維氏弧菌有明顯拮抗作用。4株芽孢桿菌的編號(hào)分別為2012070203、2011120601、20110910012和2013103110，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。對(duì)4株芽孢桿菌進(jìn)行16SrDNA序列分析，分析相關(guān)細(xì)菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)合細(xì)菌表型特征以及16SrDNA序列分析最終鑒定結(jié)果為：2012070203為蠟

5、樣芽孢桿菌，2011120601為地衣芽孢桿菌，20110910012為短小芽孢桿菌，2013103110為巨大芽孢桿菌。將4株已鑒定的芽孢桿菌分別添加到飼料中，配制成4種實(shí)驗(yàn)飼料，投喂凡納濱對(duì)蝦21d后，注射哈維氏弧菌5.98×106cfu/ml觀(guān)察14d，14d后對(duì)照組的累計(jì)死亡率為100%，蠟樣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率分別為91.11%和95.55%，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌實(shí)

6、驗(yàn)組的累計(jì)死亡率分別為77.78%和84.44%，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　第三部分：1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）腸道菌群和非特異免疫基因表達(dá)量影響的研究。實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦和感染實(shí)驗(yàn)同第二部分，其中對(duì)照組每日投喂普通商品飼料，實(shí)驗(yàn)組每日投喂在普通商品飼料中添加地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）1.0×108cf

7、u/ml配制成的實(shí)驗(yàn)飼料。養(yǎng)殖期間每7d取樣，分析對(duì)蝦腸道總菌數(shù)和弧菌數(shù)的變化。感染哈維氏弧菌后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h和7d取樣，分析地衣芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦溶菌酶（Lysozyme,Lzm）和Toll受體（Toll receptor）mRNA的相對(duì)表達(dá)量的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組可顯著降低對(duì)蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)量(P<0.05)。感染哈維氏弧菌后，實(shí)驗(yàn)組溶菌酶mRNA的相對(duì)表達(dá)量在12h、

8、18h、24h、36h、48h、72h均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組感染哈維氏弧菌后在6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、7d的Toll受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　第四部分：飼料添加單一或復(fù)合益生菌對(duì)凡納濱對(duì)（Litopenaeus vannamei）抗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytics)感染能力影響的研究。將地衣芽孢桿菌（Bacillus li

9、cheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌（1:1）添加到基礎(chǔ)飼料中，配制成的3組實(shí)驗(yàn)飼，實(shí)驗(yàn)飼料益生菌的終濃度為107cfu/g。投喂凡納濱對(duì)蝦21d后，注射感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），感染劑量為1.0×106cfu/ml，感染14d后統(tǒng)計(jì)各組的累計(jì)死亡率。14d后對(duì)照組的累計(jì)死亡率為100%，地衣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率為73.34

10、%，枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率為77.78%，地衣芽孢桿菌/枯草芽孢桿菌復(fù)合實(shí)驗(yàn)組的對(duì)蝦累計(jì)死亡率為68.89%，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)死亡率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明飼料中添加芽孢桿菌可以提高凡納濱對(duì)蝦抗副溶血弧菌感染的能力，且復(fù)合益生菌的使用效果要優(yōu)于單一益生菌。
　　第五部分：飼料添加復(fù)合益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)非特異免疫基因表達(dá)水平的影響。對(duì)蝦的養(yǎng)殖和飼料的制備同第四

11、部分，感染副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）后0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h和7d取樣，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)保護(hù)率最高的地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦相關(guān)免疫基因表達(dá)水平的分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染副溶血弧菌后，地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌組凡納濱對(duì)蝦血淋巴中的IMD、penaiedin3a、proPO、LZM和Crustin的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，且