人延伸體（Elongator）亞基Elp3及人轉(zhuǎn)錄因子TFIIF亞基RAP30對(duì)293T細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄功能的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人延伸體復(fù)合體亞基Elp3(human Elongator complex 3)及人通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIF亞基RAP30的人胚腎成纖維細(xì)胞293T穩(wěn)定細(xì)胞株，以研究其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)錄活性的影響。 方法：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將Elp3及RAP30真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入人胚腎成纖維293T細(xì)胞系進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)氨基糖苷類抗生素類似物G418篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因的單細(xì)胞克隆。采用RT-PCR法和間接免疫熒光法檢測(cè)目的基因在

2、人胚腎成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。MTI法、流式細(xì)胞儀法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Elp3及RAP30對(duì)人胚腎293T細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期的影響。我們同時(shí)采用熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)過(guò)表達(dá)Elp3、Elp4及RAP30對(duì)基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。 結(jié)果：經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光法檢測(cè)到Elp3在人胚腎成纖維細(xì)胞293T中獲得表達(dá)。MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示Elp3可以抑制293T細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀法結(jié)果顯示Elp3引起細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，但并未導(dǎo)致293

3、T細(xì)胞凋亡。熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Elp3具有促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性的作用，并且Elp3與Elp4可以協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄。我們構(gòu)建成功通用轉(zhuǎn)錄因子TFIIF亞基RAP30的真核表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定表達(dá)RAP30的人胚腎成纖維細(xì)胞293T細(xì)胞株。流式細(xì)胞儀法結(jié)果顯示RAP30基因使293T出現(xiàn)G2期阻滯。熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明RAP30可以激活轉(zhuǎn)錄，并能與Elp3協(xié)同激活轉(zhuǎn)錄。 結(jié)論：過(guò)表達(dá)Elp3可以引起人胚腎成纖維細(xì)胞293T出現(xiàn)G1期