靜脈移植骨髓間質(zhì)干細(xì)胞通過抑制神經(jīng)元調(diào)亡和促進(jìn)pax6陽性細(xì)胞存活修復(fù)大鼠腦缺血損傷的研究.pdf

1、腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，致殘率和致死率均較高。缺血性腦血管疾病治療的關(guān)鍵在于挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。神經(jīng)組織，尤其是胚胎神經(jīng)干細(xì)胞移植被認(rèn)為是可能有潛在應(yīng)用價(jià)值的手段。但是，由于存在的倫理問題、免疫排斥問題，從而限制了其廣泛應(yīng)用。大量研究發(fā)現(xiàn)有限數(shù)量的骨髓間質(zhì)千細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療腦缺血模型后，損傷的神經(jīng)功能確定有明顯的改善。探討MSCs是通

2、過什么機(jī)制促進(jìn)缺血腦損傷神經(jīng)功能的修復(fù)是目前腦缺血研究的重點(diǎn)。 體外研究證明，MSCs可以不斷分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrower factor,VEGF)等細(xì)胞營養(yǎng)因子，這些營養(yǎng)因子是細(xì)胞存活、生長、分化的重要物質(zhì)。研究還發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用外源性VEGF能夠促進(jìn)缺血腦內(nèi)血管增生，防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡；在血管系統(tǒng)能上調(diào)損傷區(qū)SDF-1表達(dá)募集CXCR<,4>陽性的細(xì)胞。因此，有必要弄清移植到腦內(nèi)的MSC

3、s是否通過產(chǎn)生VEGF等細(xì)胞營養(yǎng)因子，從而發(fā)揮對(duì)缺血損傷神經(jīng)元的保護(hù)及修復(fù)作用。本課題從骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與缺血損傷的神經(jīng)元凋亡和pax6陽性細(xì)胞存活存在的時(shí)間和空間的相互關(guān)系入手，著重從細(xì)胞和分子水平研究MSCs對(duì)缺血損傷神經(jīng)元的保護(hù)及修復(fù)作用及其機(jī)理；并通過MSCs移植，進(jìn)一步探討MSCs移植治療局灶性腦缺血的效果，移植到腦內(nèi)的MSCs產(chǎn)生VEGF的情況，以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡、pax6陽性細(xì)胞存活、分化和遷移的變化，為臨床治療腦缺血、促進(jìn)神

4、經(jīng)功能恢復(fù)提供新的方法和思路。 一、缺氧損傷條件下存活的MSCs對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響 采用P5-10代的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行有關(guān)實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鼠MSCs的表面抗原：采用逆轉(zhuǎn)錄．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)在正常條件、缺氧條件(2﹪O<,2>，93﹪N<,2>，5﹪CO<,2>)下培養(yǎng)的MSCs和細(xì)胞移植后1天，海馬和皮質(zhì)VEGF mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示：MSCs表面抗原CD44、CD29陽性和CD45、CD34陰性

5、：MSCs誘導(dǎo)分化后神經(jīng)元特異性烯醇酶(neurone specific enolase，NSE)免疫反應(yīng)陽性；缺氧條件下培養(yǎng)MSCs能促進(jìn)自身NGF、BDNF和VEGF mRNA表達(dá)；移植入缺血腦內(nèi)的MSCs能促進(jìn)皮質(zhì)組織VEGF mRNA表達(dá)。 二、靜脈移植的MSCs修復(fù)大鼠缺血腦損傷的機(jī)制研究 (一) MSCs尾靜脈移植后在體內(nèi)的分布將魚線從左側(cè)頸外動(dòng)脈穿入大腦中動(dòng)脈末端制備永久性腦缺血大鼠模型。術(shù)后24小時(shí)從大鼠

6、尾靜脈移植BrdU標(biāo)記的MSCs，并于移植后1、3、7和14天分別采用免疫組織化學(xué)的方法觀察MSCs在體內(nèi)的分布；利用免疫熒光的方法檢測(cè)MSCs的存活。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示：移植到腦內(nèi)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在移植后1天主要分布在損傷側(cè)下丘腦腹內(nèi)側(cè)的組織間質(zhì)中；在第3天沿著損傷側(cè)的丘腦，通過第三腦室進(jìn)入海馬的CA1(cornu ammonis 1，CA1)區(qū)，然后穿過胼胝體進(jìn)入損傷的皮質(zhì)區(qū)域；在細(xì)胞移植后7天，皮質(zhì)缺血周邊區(qū)域和海馬觀察到BrdU陽性細(xì)

7、胞對(duì)Capase-3呈免疫反應(yīng)陽性；在第14天全腦沒有檢測(cè)到BrdU特異的陽性細(xì)胞。在第7和14天，肝、肺和腎的實(shí)質(zhì)組織中都能發(fā)現(xiàn)移植的MSCs存活。 (二) MSCs具有抑制缺血腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用 缺血后1天，將1×10<'6>個(gè)MSCs經(jīng)大鼠尾靜脈注入大鼠體內(nèi)；對(duì)照組采用PBS靜脈移植。于大鼠腦缺血前，細(xì)胞移植后1、7、14及28天分別采用mNSS評(píng)分方法和HE染色分別檢測(cè)成體大鼠神經(jīng)功能障礙程度和神經(jīng)病理損害；

8、利用末端標(biāo)記法測(cè)定MSCs對(duì)細(xì)胞移植后7、14和28天大鼠腦海馬、皮質(zhì)和丘腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況，利用免疫熒光雙標(biāo)方法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示：與PBS對(duì)照組相比，MSCs在移植后14和28天能顯著改善神經(jīng)功能評(píng)分但不能改善神經(jīng)病理表現(xiàn)；移植后14天大鼠腦海馬、皮質(zhì)和丘腦的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少。 (三) MSCs具有促進(jìn)pax6陽性細(xì)胞存活的作用 采用免疫單標(biāo)和雙標(biāo)方法檢測(cè)成體大鼠pax6陽性細(xì)胞存活、遷移和

9、分化的情況。尾靜脈移植MSCs后，分別于移植后7和14天觀察大鼠pax6陽性細(xì)胞存活情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：移植后7天，大鼠缺血腦的皮質(zhì)區(qū)域pax6陽性細(xì)胞明顯增多，而移植后14天，大鼠缺血腦的皮質(zhì)和海馬區(qū)域pax6陽性細(xì)胞于都明顯增多；移植后14天，在缺血鼠大腦的海馬和皮質(zhì)觀察到較多的pax6+NF200，pax6+GFAP和pax6+DCX免疫雙標(biāo)的細(xì)胞。 結(jié)論： 1 MSCs在缺氧條件培養(yǎng)下能促進(jìn)自身VEGF表達(dá)；MSCs

10、移植后能促進(jìn)缺血腦皮質(zhì)組織VEGF表達(dá)。 2 MSCs能減少缺血腦皮質(zhì)、海馬和丘腦區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表明MSCs有一定的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。 3 MSCs可顯著增加缺血腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域內(nèi)的pax6陽性細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)pax6陽性細(xì)胞呈DCX、NF200、GFAP陽性表達(dá)，表明MSCs能促進(jìn)大鼠缺血腦內(nèi)pax6陽性細(xì)胞存活并且pax6陽性細(xì)胞向損傷區(qū)遷移并分化為神經(jīng)細(xì)胞。 4 MSCs抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)p